动物双歧杆菌A12的肠道动态分布规律及其对便秘缓解效果研究

马京升，任培豪，任 颖，金君华，刘 慧

(北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室，北京 102206)

人体肠道内存在大量细菌定殖在肠道黏膜表面，与肠道黏膜细胞共同构成生物屏障，保护机体健康。已有研究证明，服用外源性益生菌，对维持机体微生态平衡、抑制病原微生物侵袭、调节免疫预防方面有重要作用[1]。然而口腔中各种消化酶、肠道中的强酸高胆盐环境给益生菌的生存带来很大的压力，所以，益生菌要定殖在肠道黏膜表面，与宿主共同抵制外来致病微生物的侵袭，就必须克服重重阻力。在口服益生菌后，了解其在胃肠道中各部分不同时间点的总菌细胞数和活菌细胞数，及连续口服一段时间后，菌细胞在机体内的保留与排空情况很有必要。不同菌种甚至不同菌株之间穿过胃肠道的能力有所不同[2]，所以在评价一株益生菌时，了解其穿过胃肠道并存活的能力以及其分布和数量尤为重要。

FENG等[3]应用实时荧光定量聚合酶链反应技术分别检测便秘患者粪便标本和结肠黏膜菌群发现，粪便标本中双歧杆菌属和乳酸杆菌属水平明显低于健康人群，结肠黏膜中双歧杆菌属存在相同的变化。此外，一项罗马基金会的研究报告显示，便秘型肠易激综合征患者肠道菌群改变主要表现为双歧杆菌属、梭菌属和柔嫩梭菌属显著减少[4]。大量研究表明，补充含有双歧杆菌的混合益生菌制剂可预防或治疗便秘，但单菌株双歧杆菌的缓解便秘作用效果不确定[5]，有研究发现单独使用乳酸双歧杆菌NCC2818对治疗功能性便秘无效[6]。

前期研究结果表明，动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)A12可以显著控制大鼠由于高糖高脂食物引起的血糖升高及体质量增加等症状[7]，具有良好的商业化应用前景，但该菌株在胃肠道的存活及其对肠道功能的影响尚未研究报道。

本研究以动物双歧杆菌A12为研究对象，基于大鼠肠道菌群环境下，设计动物双歧杆菌A12特异性引物，检测一次摄入该菌株后，其在肠道各部位的动态存活细胞数，及连续摄入后其在肠道的存活时间，探讨动物双歧杆菌A12在肠道动态分布规律；进一步利用小鼠便秘模型，探讨该菌株缓解功能性便秘的能力，为具有中国自主知识产权双歧杆菌菌株产业化开发提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 菌株及处理方法

动物双歧杆菌A12(北京农学院食品科学与工程学院食品微生物功能开发团队自主分离，保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCC 17308)，分离于母乳喂养婴儿肠道。

动物双歧杆菌A12活菌细胞：将动物双歧杆菌A12在改良MRS培养基中，37 ℃厌氧培养，每12 h做一次传代活化，将活化好的3代菌培养液，倒入离心管中5 000 r/min离心15 min，将离心好的动物双歧杆菌A12沉淀重悬于等体积的生理盐水中备用。

动物双歧杆菌A12死菌细胞：按照“1.1”中配置动物双歧杆菌A12活菌细胞的方法，得到重悬于生理盐水中有活性的动物双歧杆菌A12菌液后，再用灭菌锅121 ℃灭菌20 min，得到死菌细胞所需要的菌液。

1.2 试验动物

用于菌株肠道分布研究：SPF级SD大鼠(质量合格证编号1103241911037614)，42日龄，雄性，体质量250～260 g，购于北京兴隆动物厂，饲养于北京农学院食品科学与工程学院微生物实验室动物房，室温24 ℃，12 h光照/黑暗循环，自由饮水摄食，每天补充大鼠维持饲料，购自北京兴隆动物厂。

用于便秘缓解作用研究：SPF级Balb/c雄性小鼠(质量合格证编号1103241911038195)，42～56日龄，体质量18～22 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。饲养于北京农学院食品科学与工程学院微生物实验室动物房，室温24 ℃，12 h光照/黑暗循环，每天补充小鼠基础饲料，购自北京兴隆动物厂。

该试验已通过北京农学院动物福利与伦理审查，编号为BUA2020112。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株肠道分布研究的分组处理方法 大鼠在进行7 d适应后进行随机分组，一次灌胃组36只，连续灌胃组22只。

一次灌胃组：该组每只大鼠进行一次灌胃2.5×109CFU动物双歧杆菌A12活菌细胞，选取0.17、0.5、1、2、3、6、9、12、18、24、36和48 h进行处死，3个平行，取胃、回肠、结肠和直肠4个部位的肠道内容物，与3 mL厌氧稀释液震荡混匀制成悬浊液。每个样品取2份200 μL肠道内容物悬浊液，1份直接进行DNA提取，另1份经叠氮溴化丙锭处理后进行DNA提取。提取后的DNA样品-20 ℃备用。

连续灌胃组：该组每只大鼠进行连续7 d灌胃动物双歧杆菌A12活菌细胞2.5×109CFU。在灌胃结束后0、1、2、3、5、7、9、11、13和14 d取一部分大鼠粪便，与3 mL厌氧稀释液震荡混匀制成悬浊液，每个样品取2份200 μL肠道内容物悬浊液，1份直接进行DNA提取，另1份经70 μg/mL叠氮溴化丙锭暗处理5 min，功率500 W、距样品15 cm的光处理4 min，进行DNA提取，提取后的基因组-20 ℃备用；另一部分在灌胃结束后7 d和14 d，取盲肠和结肠2个部位的肠道内容物，与3 mL厌氧稀释液震荡混匀制成悬浊液，每个样品取2份200 μL肠道内容物悬浊液，1份直接进行DNA提取，另1份经叠氮溴化丙锭处理后进行DNA提取；提取后的DNA样品-20 ℃备用，连续灌胃后14 d结束试验。

肠道内容物基因组DNA样品的提取。取200 μL悬浊液，加入0.3 g直径0.1 mm玻璃珠，300 μL Tris-SDS溶液(250 mL的200 mmol/L Tris-HCl，80 mmol/L EDTA缓冲液；pH 9.0，50 mL 10% SDS，混匀)，500 μL Tris饱和酚，上下颠倒混匀；使用球磨机剧烈震荡30 s破碎菌细胞，16 000 r/min 4 ℃离心5 min；吸取400 μL上清于2 mL新离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)；轻轻混匀后16 000 r/min 4 ℃离心5 min；吸取300 μL上清于新的1.5 mL离心管中，加入30 μL浓度为3 mol/L乙酸钠(pH值5.2)溶液和360 μL异丙醇，轻轻混匀后16 000 r/min 4 ℃离心5 min；弃去上清，加入70%乙醇500 μL，16 000 r/min 4 ℃离心5 min；弃去上清，温室干燥30 min；加入pH值8.0的100 μL TE，5 μL RNase，混匀后37 ℃放置10 min，提取后的肠道内容物DNA样品-20 ℃备用。

肠道中动物双歧杆菌A12活菌细胞、总菌细胞定量检测。将冻存备用的DNA样品，进行定量PCR检测，重复3次。正向引物CGCTCAAGCACTGCAATCAC，反向引物GATTGCTCGG GCGATTTGTG，引物20 bp；引物Tm值：正向引物57.5 ℃，反向引物57.6 ℃，GC含量为55%，扩增片段大小为197 bp。定量PCR反应体系20 μL：DNA模板1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，TB Green©Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，货号RR820A，TAKARA)10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL。定量PCR的反应程序：预变热反应95 ℃，5 min；循环反应95 ℃，30 s；57.6 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40个循环。保守延伸反应72 ℃，3 min。

1.3.2 菌株缓解便秘效果研究的分组处理方法 小鼠随机分为4组：对照组、模型组、活菌细胞组、死菌细胞组，各个组分成2个平行小组，每小组包括小鼠6只，共计48只，小鼠进行适应性饲养7 d。

对照组和模型组每只小鼠每天灌胃生理盐水1 mL，活菌细胞组每只小鼠每天灌胃动物双歧杆菌A12活菌细胞2.5×109CFU，死菌细胞组每只小鼠每天灌胃动物双歧杆菌A12死菌细胞2.5×109个。

1.3.3 小鼠排便试验 灌胃动物双歧杆菌A12的小鼠7 d后，各组小鼠禁吃饲料但不禁水16 h。模型组、活菌细胞组、死菌细胞组小鼠灌胃10 mg/kg复方地芬诺酯悬液(常州康普药业有限公司)，对照组灌胃蒸馏水。

给予药物复方地芬诺酯0.5 h后，对照组和模型组每只小鼠灌胃0.1 mL的墨汁(100 g的阿拉伯树胶，加入800 mL的蒸馏水，煮沸，待溶液透明后加入50 g活性炭粉，煮沸2～3次，冷却后定容到1 000 mL，放在4 ℃冰箱中保存，用前摇匀[8-9])，动物双歧杆菌A12菌细胞悬液与墨汁等体积混合，活菌细胞组、死菌细胞组的每只小鼠灌胃含动物双歧杆菌A12的墨汁0.1 mL，重新开始正常饮水进食。

从给小鼠灌胃墨汁开始，立即将它们转移到新的代谢笼中，以模型组最后一只小鼠的排出首粒黑便的时间为终止，记录各组每只小鼠的排出首粒黑便时间。并记录5 h内的排黑便粒数、黑便质量。收集的粪便要立即进行含水量的测定，105 ℃烘干5 h至质量恒定，按照(1)式测定粪便的含水率[10]。

粪便含水率(%)=[1-(烘干后的质量/烘干前的质量)]×100%

(1)

1.3.4 小肠推进试验 小肠有3种运动方式：蠕动、张力收缩运动和分节运动，以蠕动方式推动肠内容物移动为主要方式。灌胃复方地芬诺酯，建立小鼠小肠蠕动的抑制模型后，再用墨汁为标记物，观察动物双歧杆菌A12对便秘小鼠肠道蠕动的影响，做小肠推进试验。

灌胃动物双歧杆菌A12的小鼠14 d后，各组小鼠禁饲料但不禁水16 h。模型组、活菌细胞组、死菌细胞组小鼠灌胃10 mg/kg复方地芬诺酯悬液，对照组灌胃蒸馏水。

给复方地芬诺酯30 min后，对照组和模型组小鼠灌胃墨汁0.1 mL/kg；动物双歧杆菌A12菌悬液与墨汁等体积混合，活菌细胞组、死菌细胞组的小鼠灌胃含动物双歧杆菌A12的墨汁0.1 mL/kg。25 min后利用脱颈椎法使小鼠死亡，解剖腹腔分离出肠系膜，取从幽门到回盲部的肠管，将小肠拉成直线，平铺在刻度尺上即为肠管总长度(cm)，从幽门开始量至墨汁推进前沿为墨汁推进长度(cm)，记录每个小鼠的数据并计算墨汁推进距离占小肠总长的百分比，即为墨汁推进率，按式(2)计算[11]。

墨汁推进率(%)=(墨汁推进长度/小肠总长度)×100%

(2)

2 结 果

2.1 一次灌胃组动物双歧杆菌A12的胃肠道分布情况

采用不同时间点对大鼠进行处死处理，提取其胃、回肠、结肠、直肠4个胃肠道部位肠道内容物的DNA，结合定量PCR进行菌细胞数的检测，以时间为横坐标，定量PCR检测菌细胞数为纵坐标绘制分布规律曲线(图1)。

胃中，动物双歧杆菌A12总菌细胞数和活菌细胞数随时间的增加而减少，0.17 h总菌细胞数和活菌细胞数达到最大值，分别为108.78个/g肠道内容物和108.48CFU/g肠道内容物，存活率达到50.1%，3 h之后活菌细胞数快速下降到检测限以下，9 h总菌细胞数已经低于检测限。

回肠中，动物双歧杆菌A12菌细胞摄入10 min后即可到达，总菌细胞数及活菌细胞数均随时间的增加呈现先上升后下降的趋势，0.5 h时总菌细胞数和活菌细胞数达到最大值，分别为108.48个/g肠道内容物和107.18CFU/g肠道内容物，存活率约为5.0%，3 h后迅速下降，9 h时活菌细胞数低于检测限，24 h时总菌细胞数低于检测限。

结肠中，3 h时可以检测到动物双歧杆菌A12但未检测到活菌细胞，表明菌细胞摄入后至多3 h，便可以到达结肠部位，随后总菌细胞数和活菌细胞数均呈现先上升后下降的趋势，6 h总菌细胞数和活菌细胞数达到最大值，分别为108.08个/g肠道内容物和107.58CFU/g肠道内容物，存活率31.6%，明显高于回肠部分；36 h后结肠中的总菌细胞数和活菌细胞数均低于检测限。

直肠中，3 h可以检测到动物双歧杆菌A12总菌细胞，但未检测到活菌细胞，表明菌细胞摄入后至多3 h，便可以到达直肠部位，总菌细胞数及活菌细胞数呈现出先上升后下降的趋势，但与结肠不同的是，直肠部位是在摄入菌细胞12 h后，总菌细胞数及活菌细胞数才达到最大值，分别为107.48个/g肠道内容物和106.88CFU/g肠道内容物，比结肠的峰值到来时间推迟9 h，同时表明大鼠摄入的动物双歧杆菌A12，主要在9 h时排出体外，此时菌细胞的存活率为25.1%，但可以在体内保留36 h左右，此时菌细胞的存活率为63.1%，48 h后总菌细胞数及活菌细胞数低于检测限。

2.2 连续灌胃组动物双歧杆菌A12的保留与排空情况

采用通过给大鼠连续7 d灌服2.5×109CFU的动物双歧杆菌A12菌细胞，灌服结束后收集大鼠粪便进行DNA提取，并结合定量PCR进行总菌细胞数及活菌细胞数的检测，以时间为横坐标，定量PCR检测总菌细胞数对数值及活菌细胞数对数值为纵坐标绘制分布曲线，结果如图2。

连续7 d灌服2.5×109CFU动物双歧杆菌A12的大鼠，灌胃结束(0天)活菌细胞为106.68CFU/g肠道内容物，灌胃结束后1 d，即24 h，总菌细胞数达到107.08个/g肠道内容物，活菌细胞106.40CFU/g肠道内容物，均分别显著高于一次灌胃结束24 h的总菌细胞数(105.75个/g肠道内容物)和活菌细胞数(105.50CFU/g肠道内容物)；灌胃结束2 d，即48 h，总菌细胞数106.02个/g肠道内容物，活菌细胞数105.32CFU/g肠道内容物，均分别显著高于一次灌胃结束48 h的总菌细胞数和活菌细胞数(低于检测限)。灌胃后3 d已经检测不到活菌细胞存在，总菌细胞数105.86个/g肠道内容物，灌胃结束后第7天，总菌细胞数仍可检出为105.51个/g肠道内容物；第9天，动物双歧杆菌A12总菌细胞数低于检测限，表明动物双歧杆菌A12连续摄入7 d后，可在体内至少保留7 d。

2.3 连续灌胃组动物双歧杆菌A12在盲肠与结肠的定殖情况

连续7 d摄入动物双歧杆菌A12结束后，为进一步检测其在体内定殖情况，收集灌服结束后7 d和14 d的盲肠和结肠肠道内容物进行DNA提取，结合定量PCR进行总菌细胞数及活菌细胞数的检测，结果见表1。

表1 动物双歧杆菌A12在大鼠盲肠与结肠中的保留

在灌胃结束后7 d，盲肠中检测到105.98个/g肠道内容物的动物双歧杆菌A12总菌细胞，但未检测到活菌细胞；结肠中检测到105.48个/g肠道内容物的动物双歧杆菌A12总菌细胞，未检测到活菌细胞；14 d后大鼠盲肠及结肠内均未检测到动物双歧杆菌A12菌细胞。

2.4 动物双歧杆菌A12对小鼠便秘的缓解效果

为了进一步探讨可以活着通过胃肠道的动物双歧杆菌A12在肠道中发挥的作用，设计小鼠便秘模型，评价该菌株对便秘小鼠的粪便质量，排便时间即肠道蠕动功能的影响。

动物双歧杆菌A12对便秘小鼠排便指标的影响见表2。在粪便含水率方面各组的数据并没有太大的变化，说明动物双歧杆菌A12在缓解大便干燥方面并没有显著的功效；模型组的小鼠排出首粒黑便的时间、5 h内排出黑便的颗粒数、粪便的质量等指标均与对照组比较有极显著差异(P<0.01)，这说明便秘小鼠模型造模成功；活菌细胞组的小鼠排出首粒黑便时间、5 h内排便量、排便数目与模型组相较达到极显著的水平(P<0.01)，而死菌细胞组对便秘小鼠排便指标的影响与模型组相较无显著差异(P>0.05)。

表2 动物双歧杆菌A12对便秘小鼠排便指标的影响Tab.2 Effect of B. animalis A12 on defecation index of constipated mice

模型组与对照组的墨汁推进率有极显著差异(P<0.01)，表明小鼠造模成功；活菌细胞组与模型组的墨汁推进率之间有极显著差异(P<0.01)，表明动物双歧杆菌A12活菌细胞具有促进小肠蠕动和内容物的排出，缓解便秘的功效；而灌胃动物双歧杆菌A12死菌细胞的小鼠的墨汁推进率与模型组比较无显著差异(P>0.05)，表明动物双歧杆菌A12的死菌细胞并无促进便秘小鼠肠道蠕动的作用(表3)。

表3 便秘小鼠的墨汁推进率Tab.3 Promoting rate of ink in mice with constipation

3 讨 论

用PCR法对大鼠肠道环境中动物双歧杆菌进行检测，为了进一步验证该方法所用引物特异性，在灌胃前对大鼠肠道内容物DNA进行PCR检测，均未检测到动物双歧杆菌A12的特征产物条带，说明选用的大鼠肠道内无内源性动物双歧杆菌可检出，表明叠氮溴化丙锭与聚合酶链式反应结合方法结合特异引物可用于检测动物双歧杆菌A12在大鼠肠道内的动态分布情况。在小肠中十二指肠和空肠中内容物极少，回肠内容物含量相对较多，便于收集样品检测；在大肠中，盲肠的环境极为复杂，而且研究多为检测菌群丰度，在研究过程中不具有指导意义，结肠中的环境较适宜菌细胞的生存，因此，对结肠的研究较多[12]，菌株在此部位的分布具有较高价值；直肠是检测菌细胞保留与排空的重要部位，也是研究菌株定殖的主要部位[12-13]；这是本研究选取胃、回肠、结肠和直肠4个部位作为研究菌株胃肠道分布规律的基础。

罗佳和金锋[14]及COLLADO等[15]通过给健康志愿者口服动物双歧杆菌DN-173010，连续28 d，每天服用1.4×109CFU/mL，并利用双歧杆菌属特异探针结合荧光原位杂交技术每7 d对动物双歧杆菌DN-173010菌细胞进行检测，得出菌细胞随着口服时间的延长而增多，从最初的108.52CFU/g湿粪便的排出量，28 d后可达1010.41CFU/g湿粪便，口服结束后28 d动物双歧杆DN-173010的菌细胞恢复至初始水平，但是该研究并未针对动物双歧杆菌DN-173010菌株进行特异性检测，也未分辨该菌株的死菌细胞、活菌细胞，同时无法说明菌株在体内的保留时间。另外，乔雪微[12]的研究表明长双歧杆菌BBMN68在被连续摄入7 d后，停止摄入的第3天就不能在大鼠的粪便中检测到长双歧杆菌BBMN68菌株，至于是否在体内保留，未开展研究。而本研究表明动物双歧杆菌A12活菌细胞至少可在体内保留2 d，总菌细胞保留7 d以上。

不同种属的双歧杆菌主要是通过增加粪便中乙酸的含量，对于便秘均有缓解作用[10]，但这种便秘的缓解效果具有菌株特异性。乙酸是结肠发酵的主要产物。增加肠内乙酸量可导致肠道渗透压增加，肠内容物含水量增加，从而刺激肠壁，增加肠蠕动[16]，死菌细胞不具有分泌乙酸的能力，因此本研究中的动物双歧杆菌A12死菌细胞组对于促进肠道蠕动没有显著效果。本研究中，动物双歧杆菌A12活菌细胞可以把便秘小鼠的小肠蠕动速率提高41.1%，与王琳琳[10]研究发现的动物双歧杆菌CCFM 625可以把便秘小鼠的小肠蠕动速率提高25%相比具有菌株优势，同时，对照组没有显著差异，可以保持正常水平。

每只大鼠一次灌服动物双歧杆菌A12活菌细胞2.5×109CFU，胃的排空时间为6 h、回肠排空时间为24 h、结肠的排空时间为36 h、直肠排空时间为48 h。每只大鼠连续7 d灌服动物双歧杆菌A12活菌细胞2.5×109CFU，动物双歧杆菌A12活菌细胞至少可在体内保留2 d，定位在结肠和直肠，总菌细胞保留7 d以上。此外，动物双歧杆菌A12的活菌细胞可以显著提高小鼠的排便数量和质量，提高含水量，缩短排便时间，促进小肠蠕动，缓解其便秘表征。