BasS/BasR双组分系统调控大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1敏感性研究

陈欣玥，金君华，张红星，谢远红

(北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/ 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京102206)

乳酸菌细菌素是由乳酸菌产生的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽，近年来乳酸菌细菌素以其稳定无毒、不改变食品风味的特点常作为一种新型生物防腐剂应用于食品加工与贮藏中，且有望成为抗生素的替代品[1]。细菌素按照化学结构与分子量大小可分为四类：分子量为5 kD的羊毛硫抗生素[2]；分子量小于10 kD的小分子热稳定肽，分为IIa、IIb、IIc这3个亚类[2]；分子量大于10 kD的热敏感大分子蛋白[2]；复合型乳酸菌细菌素[2]。目前，在所有乳酸菌细菌素中，针对IIa类乳酸菌细菌素的研究较为深入[3]：IIa类乳酸菌细菌素是由乳酸菌代谢产生的、具有革兰氏阳性单增李斯特菌强抑菌活性的、未修饰的小分子热稳定肽[3-4]。IIa类细菌素对革兰氏阴性菌的作用方式主要是与敏感菌的细胞膜相互作用，引起敏感菌细胞膜的改变，使细菌发生崩解死亡[5]。革兰氏阴性菌对于IIa类细菌素敏感性的调控机制与作用靶点目前研究尚未定论。

双组分系统是存在于细菌细胞内、协助细菌感知适应不同环境变化的最普遍机制之一[6]。一个典型的双组分系统是由一个位于内膜上的传感器激酶(组氨酸激酶)和一个细胞质中的反应调节因子组成[7-9]。大肠杆菌BasS/BasR双组分系统是大肠杆菌中的锌铁感应转录调节剂，其中BasS(又称PmrB)为传感器激酶蛋白，BasR(又称PmrA)为反应调节剂，在大肠杆菌外界环境改变时，通过磷酸化激活下游靶基因转录，改善细胞状态，维持细胞稳定[10-13]。已有研究表明，BasS/BasR双组分系统通过修饰细胞膜来增加大肠杆菌的抗药性，如对多粘菌素B的抗性[14]。BasS/BasR双组分系统调控大肠杆菌对植物乳杆菌素抗性的研究较少。

在前期研究中，本课题组从传统发酵肉制品中分离鉴定得到1株植物乳杆菌BM-1。植物乳杆菌BM-1能够代谢产生一种IIa类乳酸菌细菌素即植物乳杆菌素BM-1。该细菌素对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等都有一定的抑菌作用[12]。

本研究旨在筛选大肠杆菌(Escherichiacoli)中与植物乳杆菌素BM-1直接作用的大肠杆菌细胞膜上的互作蛋白，并分析其影响大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1的敏感性作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073、突变型大肠杆菌JW4074是2016年10月购于大肠杆菌突变体库KEIO collection，详情见表1。

表1 菌株特性及来源Tab.1 Strain features and source

植物乳杆菌BM-1产植物乳杆菌素BM-1，由北京农学院农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室保藏。

MRS肉汤，MRS琼脂培养基，LB培养基[13]，制备培养基使用的试剂均为国产分析纯级；硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、EDTA、尿素和脱氧胆酸钠，购于国药集团化学试剂有限公司；琼脂，购于北京奥博星生物技术有限公司；3500Da透析袋，购于北京瑞达恒辉科技发展有限公司；Bacteria RNA Extraction Kit、HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 试验仪器

DL-CJ-1NDII超净台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；LHS-100CH恒温恒湿箱，上海一恒科技有限公司；DYY-6DCP-32B型恒流电泳仪，北京六一仪器厂；GL-21M台式冷冻离心机，上海沪湘仪离心机仪器有限公司。

BT2202S电子天平(Starorius)，StepOnePlus Real-Time PCR System(ABI)，磁力架(苏州海狸生物科技有限公司)，MiniBeadBeater-16(BioSpec)，翻转架(北京大龙兴创实验仪器有限公司)，电导仪(Mettler)，紫外分光光度计(上海佑科仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 植物乳杆菌素BM-1的制备 采用pH介导细胞吸附-解吸技术与阳离子交换色谱法纯化植物乳杆菌素BM-1[12]。将植物乳杆菌素BM-1培养液加热后调节pH至pH值6.0，于室温条件下搅拌30 min，使植物乳杆菌素BM-1吸附到细胞表面；离心收集细胞，洗涤沉淀后，使用100 mmol/L NaCl重悬，调节pH至pH值2.0，4 ℃条件下搅拌12 h，离心后上清4 ℃条件下使用ddH2O透析24 h，冷冻干燥后得到第一步纯化后的植物乳杆菌素BM-1。使用柠檬酸钠缓冲液重悬第一步纯化后的植物乳杆菌素BM-1；使用SP-Sepharose快速流动阳离子交换色谱柱(长度200 mm，内径10 mm)将重悬后的植物乳杆菌素BM-1上样，使用pH值3.1的柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，直到检测不到280 nm处吸光值；使用0.1～0.5 mol/L NaCl线性梯度洗脱植物乳杆菌素BM-1，收集活性成分，使用ddH2O透析后得到纯化的植物乳杆菌素BM-1，用牛津杯测定此时细菌素效价[12]。

1.3.2 大肠杆菌与植物乳杆菌素BM-1互作蛋白的筛选 以1×102CFU/mL接种量将野生型大肠杆菌K12接种到5 mL LB培养基中，37 ℃培养至菌液OD值为0.5。菌液中加入植物乳杆菌素BM-1至最终效价为512 AU/mL，37 ℃培养2 h；以不添加植物乳杆菌素BM-1的大肠杆菌为对照。12 000 r/min将培养好的菌液离心10 min，弃上清，用1 mL PBS(pH值7.4)复溶离心后的菌液沉淀，加入0.3 g玻璃珠(100 mm)，使用Beadbeater破碎菌体2次。静置破碎后的菌液，小心吸取上清，12 000 r/min离心上清10 min，向沉淀中加入9倍体积包涵体裂解液，室温下静置30 min，12 000 r/min离心5 min，使用包涵体溶解液溶解沉淀，得到菌体蛋白。取490 μL菌体蛋白溶液，加入10 μL偶联植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体的磁珠[15]，4 ℃旋转反应过夜。反应后磁珠用1×PBS缓冲液和0.1%脱氧胆酸钠洗涤2次，蛋白电泳检测洗脱液。

蛋白洗脱液使用液相色谱-串联质谱进行蛋白鉴定：首先使用Orbitrap Fusion Lumos与Easy-nLC 1000液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific)，用0.1%甲酸水溶液溶解标记样品，将溶解后肽段装载至C18反相柱(预柱填料粒径3 μm，孔径120Å，2 cm×100 μm ID；分析柱填料粒径1.9 μm，孔径120Å，15 cm×150 μm ID)进行预分离，流速600 nL/min，洗脱60 min；使用Lumos3质谱仪(Thermo Fisher Scientific)，采用DDA模式(data-dependent acquisition mode)进行分析。一级质谱使用Orbitrap进行全扫描，扫描范围350～1 550 m/z，扫描分辨率120 000，AGC targets为4e5 ions，Max injection time为50 ms；二级质谱采集通过32%的高能碰撞解离(HCD)对母离子进行碎裂，碎片离子在Orbitrap中进行检测，First Mass为100，分辨率15 000，AGC targets为5e4 ions，Max injection time为22 ms，动态排除30 s；最后采用Proteome Discoverer2.1软件对质谱数据进行分析，得到蛋白定性和定量信息。

1.3.3 BasS/BasR双组分系统缺失大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1的敏感性分析 取生长至对数期的野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073和突变型大肠杆菌JW4074，将这3种菌液分别接种至5 mL的LB培养基中，使其终浓度为1×102CFU/mL，加入植物乳杆菌素BM-1，使其效价为512 AU/mL；以不添加植物乳杆菌素BM-1的野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073和突变型大肠杆菌JW4074为对照。37 ℃培养24 h，每隔2 h进行1次菌落计数，最终绘制出植物乳杆菌素BM-1作用下3株大肠杆菌的活菌数曲线[16]。

1.3.4 植物乳杆菌素BM-1对缺失BasS/BasR双组分系统大肠杆菌电导率的检测 将接种量是1×102CFU/mL的野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073、突变型大肠杆菌JW4074分别接种到5 mL培养基中，并加入植物乳杆菌素BM-1使其最终效价为512 AU/mL，37 ℃培养14 h，每隔2 h测1次电导率；以不加植物乳杆菌素BM-1的野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073、突变型大肠杆菌JW4074为对照。

1.3.5 BasS/BasR双组分系统缺失对大肠杆菌基因表达的检测 将接种量是1×102CFU/mL的野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073、突变型大肠杆菌JW4074分别接种到5 mL培养基中，37 ℃培养12 h。提取细菌总RNA进行实时荧光定量PCR反应。反应条件为50 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循环，使用引物如表2所示。将野生型大肠杆菌K12作为内参因子，使用2-△△Ct法计算突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074中各个基因的相对表达量。

表2 引物序列Tab.2 Sequence of primers

1.3.6 数据处理与分析 试验至少重复3次，数据以平均值±标准偏差表示，并对数据进行方差分析(ANOVA)。使用Origin 2019程序绘制图表。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 大肠杆菌与植物乳杆菌素BM-1互作蛋白的筛选

植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体进行免疫共沉淀后洗脱蛋白电泳如图1所示。第1泳道内经植物乳杆菌素BM-1处理后的大肠杆菌在20 kD处出现明显条带，第2泳道的大肠杆菌同样在20 kD处出现较暗的背景蛋白条带。经蛋白质谱对比去除大肠杆菌的背景蛋白后，筛选得到一个丰度指标0.233，分子量为25.015 kD，含有222个氨基酸且可信度高的大肠杆菌菌体蛋白，质谱鉴定其为大肠杆菌DNA结合转录双调节因子BasR(P30843)。

2.2 BasS/BasR双组分系统缺失大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1的敏感性影响

使用活菌计数法进一步分析BasR蛋白所在BasS/BasR双组分蛋白基因突变对大肠杆菌植物乳杆菌素BM-1敏感性的影响，结果如图2所示。野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074这3株大肠杆菌在不添加植物乳杆菌素BM-1单独培养时，均呈现典型的生长规律。野生型大肠杆菌K12在单独培养6 h时，活菌数呈现上升趋势，进入指数增长期，并在12 h达到稳定期，此时活菌数为9.38 lgCFU/mL，此后24 h内活菌数呈现稳定状态。突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074在不添加植物乳杆菌素BM-1时，生长趋势总体与野生型大肠杆菌K12相似，但进入指数期较野生型大肠杆菌K12更为提前，4 h活菌数呈现上升趋势，进入指数增长期，且在指数增长期增长速度更快。在此之后的8 h和10 h处突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074的活菌数达到稳定期，最终活菌数分别为7.24 lgCFU/mL和7.27 lgCFU/mL。

添加植物乳杆菌素BM-1培养后，野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074这3株大肠杆菌活菌数在24 h内的变化趋势与单独培养相比产生明显变化。添加植物乳杆菌素BM-1后，野生型大肠杆菌K12在前14 h培养时间内活菌数增加明显被抑制，未出现变化，第16小时活菌数呈现上升趋势，进入指数期，第24小时活菌数达到6.33 lgCFU/mL。相比之下，添加植物乳杆菌素BM-1培养后，突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074的生长在前14 h被抑制，第16小时活菌数进入指数增长期，但增长速度较同时期相同培养条件的野生型大肠杆菌K12更为缓慢，且相对于单独培养时，添加植物乳杆菌素BM-1后突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074这2株突变型大肠杆菌的指数增长期被延后，到达指数期的时间与添加植物乳杆菌BM-1培养的野生型大肠杆菌K12相同。第24小时突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074的活菌数分别为4.67 lgCFU/mL与4.91 lgCFU/mL，显著低于野生型大肠杆菌K12第24小时的活菌数。说明植物乳杆菌素BM-1对突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074的生长造成的影响更大，即相对于野生型大肠杆菌K12，BasS/BasR双组分系统缺失的突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074对植物乳杆菌素BM-1更敏感。

2.3 植物乳杆菌素BM-1对缺失BasS/BasR双组分系统大肠杆菌电导率的影响

野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073与突变型大肠杆菌JW4074这3株大肠杆菌在添加与不添加植物乳杆菌素BM-1条件下培养的电导率在14 h内均呈现缓慢上升趋势，但添加植物乳杆菌素BM-1培养的大肠杆菌与单独培养的大肠杆菌的电导率变化趋势相似，差异均不显著，未产生明显对比(P>0.05)，见图3。虽然这3株大肠杆菌均对植物乳杆菌素BM-1表现出不同程度的敏感性，但植物乳杆菌素BM-1的添加并未造成大肠杆菌细胞膜的破裂和内容物外泄。

2.4 BasS/BasR双组分系统缺失对大肠杆菌基因表达的影响

提取野生型大肠杆菌K12、突变型大肠杆菌JW4073、突变型大肠杆菌JW4074的总RNA(图4)，实时荧光定量PCR检测结果如图5所示。突变型大肠杆菌JW4073的dgka基因与野生型大肠杆菌K12相比显著下调了71%，mlaf基因下调了37%。突变型大肠杆菌JW4074与野生型大肠杆菌K12相比，dgka基因显著下调了93%，mlaf基因显著下调了71%，eco基因显著下调了95%。在不表达BasS/BasR双组分系统后，突变型大肠杆菌中细胞膜结构与功能相关蛋白表达被降低。

3 讨 论

细菌素来源广泛，种类繁多，且低毒性与不易产生耐药性的特点引起人们广泛关注，但目前针对IIa类细菌素对革兰氏阴性菌的抑菌机理以及作用靶点研究还不够深入[17-18]。本试验通过免疫共沉淀筛选得到与IIa类细菌素植物乳杆菌素BM-1产生作用的大肠杆菌菌体蛋白BasR，其属于BasS/BasR双组分系统，该双组分系统的基因突变导致大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1敏感性加强，证明BasS/BasR双组分系统能够调控大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1的敏感性。

以往的研究表明，对于革兰氏阴性菌，IIa类细菌素对其作用方式是通过与菌体细胞表面产生静电作用从而使细菌素吸附在细胞膜表面，穿过脂多糖，进入细胞质膜，造成孔洞，从而破碎菌体细胞，使内容物外泄，达到杀菌作用[19-20]。本研究中电导率结果显示大肠杆菌细胞膜并未破裂，说明植物乳杆菌素BM-1对大肠杆菌的作用方式与已有的IIa类细菌素对革兰氏阴性菌的作用方式不同，即添加植物乳杆菌素BM-1后，大肠杆菌细胞膜并未破裂。结合大肠杆菌生长曲线结果，推断植物乳杆菌素BM-1对大肠杆菌的作用方式为抑制细菌生长而不是通过破碎细胞导致菌体死亡。

本研究中发现BasS/BasR双组分系统参与大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1敏感性调控。BasS/BasR双组分系统感应到外界环境变化被激活后，参与细胞膜结构、膜转运与结合的基因会被该双组分系统明显上调，使菌体在不利环境下依然保持稳定[21]。大肠杆菌BasS/BasR双组分系统的调控机制与沙门氏菌中PmrA/PmrB双组分系统相类似[22]，组氨酸蛋白激酶BasS感知到细菌外界环境变化后，由HATPase结构域供能，BasS蛋白hisKA结构域的组氨酸被磷酸化，将信号传递给反应调节因子BasR蛋白，从而激活下游靶基因转录[23-24]。相关研究表明，肠杆菌科细菌BasS/BasR双组分系统可通过诱导下游靶基因转录的方式，修饰脂质A，参与细胞膜磷脂双分子层的修饰，来达到抵抗多粘菌素B的作用[25]。BasS/BasR双组分系统调控下游靶基因，包括参与膜结构形成与修饰的dgka、调节膜功能的mlaf、参与细胞应激反应功能的eco等，这些基因的表达均可以稳定细胞膜形态[24]。相关试验已经证实在添加植物乳杆菌素BM-1的条件下，野生型大肠杆菌K12可通过加速肽聚糖合成，调节细胞膜表达，维持细胞超微结构的方式来抵御来自细菌素的伤害[26]。本试验结合已有研究结果，将大肠杆菌BasS/BasR双组分系统与大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1抗性相关联，通过RT-qPCR验证大肠杆菌中BasS/BasR双组分系统蛋白基因突变，Dgka、MlaF、Eco这3个蛋白编码基因的转录表达水平显著变化，证明该双组分系统的缺失确实降低大肠杆菌中dgka，mlaf和eco等基因转录水平的表达，从而弱化大肠杆菌细胞膜强度，降低大肠杆菌细胞膜刚性，提高大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1的敏感性。

植物乳杆菌素BM-1针对野生型大肠杆菌K12的作用体现在抑制细菌生长，并非导致菌体破裂死亡，而大肠杆菌BasS/BasR双组分系统的缺失会导致大肠杆菌对植物乳杆菌素BM-1敏感性提高，从而有效增强植物乳杆菌素BM-1对大肠杆菌的抑制效果。