植物乳杆菌SD26的筛选及对白色念珠菌的抑菌作用

乔荣更，张红星，谢远红，金君华，刘 慧

(北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室，北京 102206)

白色念珠菌(Candidaalbicans)是口腔中最常见的致病性真菌，当局部微环境改变或者口腔菌群失衡时，白色念珠菌就会转变为致病菌，引起黏膜念珠菌病或系统性念珠菌病[1]。若治疗不及时，会有癌变的风险，而目前主要采用的抗生素疗法不仅会破坏口腔菌群的正常生态，还会导致耐药性问题，因此选择安全有效的治疗手段具有重要的意义[2]。

在自然界中，乳酸菌广泛存在各种发酵食品中，尤其是泡菜，是一种公认的益生菌[3]。乳酸菌作为活的微生物，当在人体中达到一定数量时，会对人体健康有益[4]。据报道，有学者研究发现乳酸杆菌和白色念珠菌共培养后能有效抑制白色念珠菌的生长[5]。本研究旨在为应用益生菌防治口腔白色念珠菌提供基础，为后续在中国生产研发相关产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

1.1.1 材 料 白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC10231：购自美国典型菌种保藏中心，所用培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；泡菜样品采样自四川大凉山农家泡菜，所用培养基为乳酸细菌培养基。现均保存于北京农学院食品质量与安全北京实验室-81 ℃菌库中。

乳酸细菌培养基制备参见文献[6]。酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：2 g胰蛋白胨、1 g酵母浸粉、2 g葡萄糖，溶于100 mL去离子水，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，其固体培养基每100 mL含1.5 g琼脂粉。

1.1.2 仪 器 细菌基因DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。0.22 μm无菌过滤器，Merck MiLLipore公司；牛津杯(内径6.5 mm，外径8.0 mm)，北京先驱威锋技术开发公司。DL-CJ-1N超净工作台，北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；pHS-3B便携式酸度计，上海雷磁仪器厂；游标卡尺，杭州易宏制造有限公司。

BIOFUGE STRATOS台式冷冻离心机、Thermo Scientific；PTC-200型PCR仪，BIO-RAD公司；扫描电镜SU8100、透射电镜HT7800(80KV)，日立高新技术公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的筛选 采用涂布平板法[7]：称取5 g泡菜样品放入无菌均质袋中，加入45 mL无菌生理盐水拍打混匀后，梯度稀释，分别吸取稀释倍数为10-3、10-4、10-5、10-6的泡菜样品100 μL，涂布于含2.5% CaCO3的乳酸细菌培养基平板上，37 ℃静置培养24 h。挑取长势良好，溶钙圈明显的菌落，通过平板划线法反复分离纯化，菌株编号为SD26，甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 乳酸菌的鉴定 将菌株SD26进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验，并对其生理生化指标进行测定。试验结果对照《伯杰氏系统细菌学手册》进行菌种的初步判定[8]。

根据细菌基因DNA提取试剂盒说明操作提取菌株SD26基因DNA，以基因DNA为模板进行16S RNA基因的PCR扩增。扩增引物使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。其中PCR反应体系：DNA 1 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34次循环；最后72 ℃延伸5 min。然后将PCR扩增产物送去DNA测序(上海生工生物工程有限公司)。测序序列结果在NCBI数据库中用Blast软件搜索近似序列，将所测得的序列和从基因库中获得的相关种属的16S RNA基因序列进行比对。

1.2.3 抑菌活性测定 采用牛津杯法[9]，取100 μL活菌数为107CFU/mL的白色念珠菌于平板内，倒入适量加热熔化的酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基，摇晃均匀，待其冷却凝固后，在平板内适当的间隔依次放入牛津杯，然后取菌株SD26上清液100 μL添加至牛津杯孔内，并用等量的乳酸细菌液体培养基做阴性对照；质量浓度为20 mg/mL的抗真菌药物咪康唑、氟康唑和克霉唑做阳性对照。37 ℃静置培养24 h后测定抑菌圈直径，3个重复。

1.2.4 白色念珠菌生长曲线的测定 白色念珠菌生长曲线的测定分为2组。取活菌数为107CFU/mL的白色念珠菌100 μL接种于5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，震荡均匀。试验组添加菌株SD26上清液5 mL，对照组不添加菌株SD26上清液。置于37 ℃摇床180 r/min振荡培养，每隔0、4、8、12、16、20和24 h取样，测定其OD600 nm，3个重复，绘制白色念珠菌的生长曲线。

1.2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌数的测定 参照郭夏蕾等[10]的研究方法，并进行改进，将菌株SD26上清液，调到3.2×109CFU/mL，然后2倍稀释至菌液浓度1.6×109、8.0×108、4.0×108、2.0×108CFU/mL，用牛津杯法对活菌数为3.0×107CFU/mL的白色念珠菌做抑菌试验。其中，最小抑菌活菌数以有抑菌圈的最小活菌数值为准。

1.2.6 菌株SD26上清液对白色念珠菌细胞形态的影响 取生长至对数期的白色念珠菌菌液，分为2组，以1×104CFU/mL的接种量接到5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中振荡均匀。试验组向其中加入菌株SD26上清液5 mL，摇匀。对照组不加菌株SD26上清液。放入37 ℃摇床180 r/min振荡培养24 h。于4 ℃，1000×g离心10 min，弃上清，将离心管里的沉淀转移到1.5 mL的离心管内，沿管壁缓缓加入1 mL新预冷的2.5%戊二醛，置于4 ℃冰箱固定后扫描电镜扫描菌体表面结构和透射电镜观察白色念珠菌的细胞形态与内部构造。

1.3 统计学分析

用SPSS 18.0软件进行数据统计处理，数值均用平均值±标准差表示，采用Duncan多重比较检验，以P<0.05表示差异显著。采用Origin8.0软件进行数据分析作图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选

从泡菜样品中成功筛选分离出1株乳酸菌，稀释倍数为10-4时其溶钙圈见图1，平板划线菌落形态见图2。

2.2 乳酸菌的鉴定

该筛选菌株革兰氏染色为紫色，呈阳性。其细胞形状为杆状，接触酶和氧化酶为阴性，无芽孢形成。其理化试验结果见表1，系统发育树见图3。根据该菌种的细胞形态、生理生化特征、16S RNA基因序列等数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，鉴定结果为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SD26。

表1 筛选菌株的理化试验Tab.1 Physical and chemical tests for screening strains

2.3 抑菌活性测定结果

由牛津杯法测得菌株SD26及抗真菌药物咪康唑、氟康唑和克霉唑对白色念珠菌的抑菌活性见图4。菌株SD26对白色念珠菌的抑菌活性最大，抑菌圈直径大于25 mm。而在相同质量浓度20 mg/mL下，抗真菌药物克霉唑对白色念珠菌的抑菌圈直径明显大于咪康唑和氟康唑，但均与菌株SD26的抑菌圈直径存在显著差异(P<0.05)。

2.4 白色念珠菌生长曲线的测定结果

对照组无菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h内其OD600 nm呈逐渐上升趋势；而试验组经菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h内其OD600 nm均趋于零水平。由此表明植物乳杆菌菌株SD26上清液能显著抑制白色念珠菌的生长(图5)。

2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌数的测定结果

植物乳杆菌SD26对白色念珠菌的最小抑菌活菌数可以在某种程度上反映白色念珠菌对植物乳杆菌的敏感性，同时也能反映植物乳杆菌对白色念珠菌的抑菌效果。植物乳杆菌SD26对活菌数为3.0×107CFU/mL的白色念珠菌的最小抑菌活菌数为4.0×108CFU/mL (表2)。

表2 植物乳杆菌菌株SD26对白色念珠菌的最小抑菌活菌数Tab.2 The minimum inhibitory viable number of SD26 against Candida albicans

2.6 菌株SD26上清液对白色念珠菌细胞形态的影响

菌株SD26上清液对白色念珠菌细胞形态的影响如图6所示。经扫描电镜对白色念珠菌菌体表面观察发现，试验组和对照组中白色念珠菌菌体表面有明显的差异性。对照组正常生长状态的白色念珠菌菌体表面光滑、无褶皱、无破损现象；而试验组经菌株SD26上清液处理24 h后的白色念珠菌菌体大部分细胞表面变得粗糙、凹凸不平、扭曲变形，甚至有黏丝状物质出现，菌体表面有褶皱并伴随空洞现象。

经透射电镜对白色念珠菌菌体细胞结构观察发现，对照组正常生长的白色念珠菌菌体细胞膜与细胞壁结构完整、均一，胞浆均匀，致密；而试验组经菌株SD26上清液处理24 h后的白色念珠菌菌体细胞膜破损，细胞壁变薄，细胞内部胞质分散，出现空洞，导致内容物流出致死。

综上，植物乳杆菌SD26对白色念珠菌在细胞水平上有破坏作用。

3 讨 论

近年来，因白色念珠菌导致的口腔真菌感染率在不断增加，而目前主要采用的抗真菌药物普遍存在抗菌谱窄、不良反应强、生物利用度差和易产生耐药性等缺点，因此寻找安全、高效和不易产生耐药性的抗真菌替代方法已成为目前研究的热点[11]。而采用益生菌乳杆菌干预口腔致病菌的方法，即可以改善口腔微生态环境，又可以让有益菌成为优势菌维持口腔健康。

在泡菜中广泛存在乳酸菌且具有食品安全性，因而人们常常从泡菜中筛选分离乳酸菌菌株。杜晓华等[12]从四川发酵泡菜中筛选得到1株植物乳杆菌；周光燕[13]从发酵泡菜汁样品中分离得到8株植物乳杆菌；陈静等[14]从泡菜中分离得到4株乳酸杆菌。而本研究从四川大凉山农家泡菜中成功筛选分离出1株乳酸菌，经相关鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) SD26。有研究表明，乳酸菌在生长代谢中能产生有机酸、细菌素、过氧化氢等物质，抑制口腔致病菌的生长繁殖，从而保护口腔健康[15]。本研究中植物乳杆菌菌株SD26对白色念珠菌的抑菌圈直径可达26 mm，显著大于抗真菌药物咪康唑、氟康唑和克霉唑，证实了乳酸菌菌株生长代谢产生的物质对口腔致病菌的抑制作用。秦苏佳等[16]研究发现，植物乳杆菌CCFM8724与致龋双菌变异链球菌和白色念珠菌共培养后，白色念珠菌的生物膜结构明显变得松散，对其生物膜结构造成十分显著的破坏。而本研究是将植物乳杆菌SD26与白色念珠菌共培养测定其OD值，与对照组相比，试验组白色念珠菌的OD600 nm值在24 h趋于零水平，表明植物乳杆菌SD26对白色念珠菌的生长有破坏。王杨等[17]通过研究发现，当白色念珠菌细胞膜受到破坏和损伤时，会增加其菌体细胞膜的通透性，导致其细胞内[K+]、[Ca2+]等离子流失和DNA、RNA等大分子的泄漏，最终引起菌体死亡。本研究通过电镜试验观察到经植物乳杆菌SD26作用后的白色念珠菌菌体表面出现凹陷，菌体出现不规则形态，细胞壁残缺，细胞上出现破洞现象。推测植物乳杆菌SD26对白色念珠菌的抑菌机制是破坏菌体细胞膜的完整性。

本研究从四川大凉山农家泡菜中成功筛选分离出1株乳酸菌，经相关研究鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) SD26。将该植物乳杆菌SD26对口腔白色念珠菌进行抑菌研究，初步发现其抑菌机理可能是破坏了白色念珠菌细胞膜的完整性。