二乙烯亚胺在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗中的应用

崔德凤,黄文强，董剑辉,温海京，刘希红,张志刚,张永红*

(1.北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206； 2.杨凌知新生物科技有限公司，陕西杨凌，710016)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以水样腹泻、呕吐、脱水为特征的一种高度接触性传染病，其中不同年龄和不同品种的猪群均可感染，但对哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害较大，尤其是哺乳仔猪受害最为严重，发病率高达100%，死亡率为30%～80%[1-3]。目前，控制该病主要是以疫苗免疫为主[4]。中国现有疫苗在不同地区使用时的免疫保护效果存在一定差异，市场迫切需要高安全性、更高保护率的猪流行性腹泻疫苗[4]。本课题组前期分离出一株病毒含量高、免疫原性好的猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株，鉴定后用于疫苗的研究及生产。灭活疫苗的研发中，其灭活工艺是最为关键的一部分，好的灭活剂应该是可以彻底灭活病毒同时又不影响病毒的免疫原性，并且对外界环境和动物是安全的。传统灭活剂甲醛是通过对病毒蛋白羧基端发生作用，从而使病毒失活，失去感染性[5]。甲醛虽具有灭活病毒快速、彻底的特点，但它属致癌物，残留的游离甲醛随疫苗注入动物机体后，会产生刺激性反应，同时使部分病毒蛋白结构破坏，进而因蛋白结构发生变化而降低免疫原性[6]。近些年来，研究者对β-丙内酯、N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺(binary ethylenimine，BEI)等化学灭活剂进行诸多研究，其中二乙烯亚胺是一种烷化剂，能破坏病原微生物的核酸，使其不再具有复制能力，但不影响其蛋白成分的结构，从而最大限度保持病毒的抗原性[7-11]。二乙烯亚胺已经在疫苗生产中广泛应用，取得很好的灭活效果。

本研究用甲醛和二乙烯亚胺进行猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株的灭活，将灭活病毒液接种生长良好的Vero细胞进行灭活效果的检验，检验合格的灭活抗原乳化配苗，并进行安全和效力试验，以期为猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗工艺的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株病毒液，病毒含量107.64 TCID50/mL和Vero细胞系，F20，由杨凌知新生物科技有限公司提供；二乙烯亚胺，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代硫酸钠和甲醛购自国药集团有限公司；小白鼠，42～56日龄(约20 g/只)，12只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，猪流行性腹泻病毒中和抗体均不高于1∶4母猪所产的3～5日龄健康仔猪，35只，购自陕西省咸阳市郊某猪场。该试验已通过北京农学院动物福利与伦理审查，编号为BUA2020110。

1.2 方 法

1.2.1 二乙烯亚胺的配制 将提前配制好的1.8 mol/L二乙烯亚胺溶液330 mL与1.8 mol/L的NaOH溶液670 mL分别预温至42 ℃后混匀，磁力搅拌器搅拌，80～120 r/min离心，通风橱环境下搅拌3 h，搅拌开始后15～120 min和环化终点分别采样测定pH值(两个点的pH值为12～13)，配制成0.6 mol/L二乙烯亚胺溶液(pH值为12～13)，可在2～8 ℃保存20 d。二乙烯亚胺溶液使用之前，5 mol/L盐酸与二乙烯亚胺溶液的体积比约为1∶40，将二乙烯亚胺溶液pH值调整至8.0～8.3，尽量1 h内用完。

1.2.2 硫代硫酸钠的配制 称50 g无水硫代硫酸钠，溶于50 mL灭菌去离子水中，定容至100 mL，过滤除菌，配制成3.16 mol/L的硫代硫酸钠溶液，室温下保存备用。

1.2.3 二乙烯亚胺的毒性试验 用“1.2.1”配制好的二乙烯亚胺溶液，通过皮下注射接种小白鼠，每只0.15 mL，共6只，接种后观察27 d。同时用生理盐水注射小白鼠，每只0.15 mL，共6只，作为对照组。

1.2.4 甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒的灭活 取病毒液3瓶，500 mL/瓶，加入甲醛溶液(含40%甲醛)，998 mL病毒液中添加2 mL甲醛为0.2%甲醛溶液、997 mL病毒液中添加3 mL甲醛为0.3%甲醛溶液、996 mL病毒液中添加4 mL甲醛为0.4%甲醛溶液，将病毒液在室温条件下300 r/min搅拌24 h，分别在灭活8、12、16、20和24 h后各取10 mL置无菌容器，按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30 min以中和二乙烯亚胺，获得不同条件下灭活后的病毒液。

取病毒液3瓶，500 mL/瓶，加入二乙烯亚胺溶液，使其浓度分别为0.005、0.010和0.020 mol/L，将病毒液在室温条件下，按照甲醛灭活病毒液的方法，获得灭活8、12、16、20和24 h后的病毒液。

1.2.5 甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒灭活效果的检验 将“1.2.4”灭活后的病毒液接种至良好单层Vero细胞瓶，每瓶1 mL，吸附1 h后弃液，加入MEM培养基5 mL，置于37 ℃的5% CO2培养箱中培养3 d后，置于-15 ℃以下冻融细胞瓶，将上一代细胞冻融液接种到下一代细胞瓶中，按照此方式，将细胞液再盲传2代。观察并记录细胞是否出现细胞病变。

1.2.6 灭活病毒液无菌检验 取灭活检验合格的病毒液1 mL，接种硫乙醇酸盐培养基(Thioglycollate Medium，TG)50 mL，置35～37 ℃培养，3 d后吸取培养物，接种2支TG小管，0.2 mL每支，1支置23～25 ℃培养，1支置35～37 ℃培养，另取0.2 mL，接种胰酪胨大豆肉汤培养基(Trypticase Soy Broth，TSB)小管1支，置23～25 ℃培养，无菌生长。均培养7 d。

1.2.7 安全性检验 将灭活检验合格的病毒液与佐剂按一定比例混合后进行乳化制备灭活疫苗。将制备好的灭活疫苗以胸部肌肉注射方式接种健康易感母猪(猪流行性腹泻病毒中和抗体不高于1∶4)所产3～5日龄哺乳仔猪，1 mL/头，每组5头，设立免疫组(0.010 mol/L二乙烯亚胺灭活PEDV-WN油乳剂疫苗)、免疫对照组(0.3%甲醛灭活PEDV-WN油乳剂疫苗)和空白对照组(PBS油乳剂疫苗)，见表1，观察14 d。

表1 仔猪免疫分组情况(n=5)Tab.1 Immunization group situation(n=5)

1.2.8 效力检验

将制备好的灭活疫苗以胸部肌肉注射方式接种健康易感母猪(猪流行性腹泻病毒中和抗体不高于1∶4)所产3～5日龄哺乳仔猪，1 mL/头，每组5头，设立免疫组(0.010 mol/L二乙烯亚胺灭活PEDV-WN油乳剂疫苗)、免疫对照组(0.3%甲醛灭活PEDV-WN油乳剂疫苗)、攻毒对照组和空白对照组(PBS油乳剂疫苗)，见表2。观察14 d后进行再次免疫，7 d后各免疫组与攻毒组口服PEDV-WN株2 mL(病毒含量为107.64 TCID50/mL)，连续观察10 d。

表2 仔猪免疫分组情况(n=5)Tab.2 Piglet grouping situation(n=5)

2 结 果

2.1 二乙烯亚胺的毒性试验

二乙烯亚胺接种6只小白鼠后观察28 d，所有小鼠均健活，精神状态良好，无异常反应，表明二乙烯亚胺是安全的。

2.2 甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒的灭活效果验证

加入不同体积分数甲醛的病毒液，灭活不同时间后取样，进行灭活检验，结果见表3。0.2%甲醛，灭活24 h后，Vero细胞无细胞病变，说明病毒被完全灭活；0.3%甲醛，灭活16 h后，Vero细胞无细胞病变，说明病毒被完全灭活；0.4%甲醛，灭活12 h后，Vero细胞无细胞病变，说明病毒被完全灭活。当使用甲醛灭活病毒的时候，将其灭活条件确定为体积分数0.3%甲醛，灭活时间16 h。

表3 不同体积分数甲醛灭活病毒液检验结果Tab.3 Virus solution inactivation test results after different volume fraction of formaldehyde inactivated for different times

不同浓度二乙烯亚胺，灭活不同时间，进行灭活效果检验，结果见表4。二乙烯亚胺0.005 mol/L，灭活8～24 h后，Vero细胞均出现细胞病变，说明病毒未被完全灭活；二乙烯亚胺0.010 mol/L和0.020 mol/L，灭活8 h后，Vero细胞均出现细胞病变，说明病毒未被完全灭活，但是灭活12～24 h后，Vero细胞无病变，说明病毒已被完全灭活。当使用二乙烯亚胺灭活病毒的时候，将其灭活条件确定为浓度0.010 mol/L，灭活时间12 h。

表4 不同浓度二乙烯亚胺灭活病毒液检验结果Tab.4 Virus solution inactivation test results after different concentrations of BEI inactivated for different times

2.3 无菌检验

灭活检验合格的病毒液无菌检验见表5。灭活检验合格的病毒液均无菌生长。

表5 病毒液无菌检验结果Tab.5 Results of sterility test of virus liquid

2.4 灭活疫苗安全性检验结果

各组仔猪接种不同灭活疫苗后，连续观察14 d，各组仔猪精神状态良好，未观察到任何不良症状，剖检后观察各器官均正常，未有任何病变，见图1。

2.5 灭活疫苗效力检验结果

免疫组、免疫对照组仔猪接种不同灭活疫苗后，用PEDV-WN毒株进行攻毒，免疫对照组仔猪发病率为20%，疫苗保护率为80%；0.010 mol/L免疫组仔猪发病率为0%，疫苗保护率为100%，结果如表6所示。

表6 灭活疫苗效力检验结果Tab.6 Efficacy test results of inactivated vaccines

3 讨 论

猪流行性腹泻病毒自1970年在欧洲首次出现以来，对全球养猪业产生负面的经济影响[1]。迄今为止，通过疫苗接种保护猪群免受猪流行性腹泻病毒感染并限制猪流行性腹泻病毒传播的努力仅取得有限的成功。中国于2010年爆发猪流行性腹泻，尽管大多数猪种群已使用源自PEDV株CV777的商业疫苗进行免疫，但在中国养猪业中仍普遍存在由PEDV变异株引起的猪流行性腹泻，市场上现有的商业疫苗无法为猪群提供全面的保护。常见的猪流行性腹泻病毒疫苗主要包括：弱毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗这3种类型[4]。弱毒疫苗存在疫苗毒株不稳定、毒株返强、毒株容易扩散、疫苗储存条件要求比较高等问题，疫苗的研究与生产工艺还需要进一步探索。基因工程疫苗存在抗原量不足等问题。研究最多的就是灭活疫苗，灭活疫苗具有安全性较好、制备工艺简单以及疫苗易于运输等优点，并且灭活疫苗的免疫效果较好，具有广阔的发展空间。

在灭活疫苗的制作工艺中，病毒液的灭活是其最关键的一步。传统的灭活剂甲醛，是一种通过影响蛋白的结构而导致病毒失活的化学物质。甲醛灭活的效果容易受外界环境的影响，比如，温度、浓度、酸碱性以及病原本身各种因素，并且甲醛的毒性比较高，且不易分解，容易造成疫苗中甲醛含量偏高，对动物造成一定的危害，降低疫苗的免疫原性[5]。好的灭活剂不仅仅可以充分使病毒灭活，同时也会保证病毒的免疫原性不会受到破坏，对外界及免疫动物不会造成任何危害，储存方法以及运输具有一定的优势。近些年来，研究者对β-丙内酯、N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺等化学灭活剂进行一系列的研究，其中二乙烯亚胺是一种烷化剂，由于其保存、运输比较方便，且毒性较小，很多研究者将其作为理想的灭活剂首选。二乙烯亚胺的灭活机制主要是通过一系列的烷化反应，改变病毒DNA的结构，从而影响RNA的合成，参与病毒细胞的生命活动影响其病毒核酸的合成，最终达到灭活的效果。与传统的灭活剂甲醛相比较，二乙烯亚胺通过影响病毒核酸的合成而达到灭活的效果，不会改变病毒抗原蛋白的空间结构，从而使疫苗保持更好的免疫效果，是灭活疫苗制作工艺中比较理想的灭活剂[10-11]。许多研究表明，二乙烯亚胺已经被广泛应用到新城疫病毒、禽流感病毒、猪伪狂犬病毒等疫苗的制作工艺中，并取得理想的效果[12-13]。研究二乙烯亚胺对不同病毒最佳灭活条件的开发对灭活疫苗工艺的研究具有重要的意义。

本试验将二乙烯亚胺接种小白鼠后发现小白鼠均健活，说明二乙烯亚胺安全，可将其应用于后面的研究中。将不同体积分数的甲醛和不同浓度的二乙烯亚胺加入至猪流行性腹泻PEDV-WN株病毒液中进行病毒的灭活，当加入0.3%的甲醛，室温灭活16 h后，可使病毒完全灭活，且病毒无菌检验合格。当加入浓度为0.010 mol/L的二乙烯亚胺，在室温灭活12 h后，可使病毒完全灭活，且病毒无菌检验合格。将灭活后的病毒液乳化配苗，接种3～5日龄的仔猪，发现其安全性较好，二次免疫7 d后，对仔猪进行攻毒，二乙烯亚胺灭活制备的疫苗比甲醛灭活制备的疫苗保护率高，为100%。虽然甲醛可以使病毒液完全灭活，但是甲醛的毒性比较高，不易分解，制备的疫苗保护率达不到100%。确定使用浓度为0.010 mol/L的二乙烯亚胺对PEDV-WN株病毒液进行灭活，将其用于猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备工艺中。本研究为猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗的研究提供基础，为下一步猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的产业化生产奠定工艺基础。