柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白序列分析与真核表达

王黎霞，张 鹏，张建军，安 健*

(1.北京农业职业学院牧医系，北京 102442；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

球虫病是艾美耳属球虫感染所引起的原虫病[1]。疫苗是鸡球虫病主要的防控手段。其中，基因工程疫苗以独特的优势具有广阔的应用前景[2]，保护性抗原在球虫病重组疫苗的研制中起着十分重要的作用，寻找合适的抗原是未来球虫免疫的重要选择[3]。柔嫩艾美耳球虫微线蛋白4(Eimeriatenellamicroneme protein 4，EtMIC4)是一种新发现的艾美耳球虫蛋白，分子量240 kD，具有重复的TSP-1和EGF结构域，在球虫入侵宿主细胞的过程中起到重要的作用。JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4基因的全长序列。黄欣梅等[5]和DU等[6]利用大肠杆菌表达EtMIC4蛋白的C端，此重组蛋白免疫试验鸡，能够部分抵抗柔嫩艾美耳球虫的攻虫的致病性，然而真核表达的蛋白在表达后修饰方面优于原核表达产物，更接近原来蛋白的结构。本研究是为了获得重组柔嫩艾美耳球虫微线N端蛋白(RecombinantEimeriatenellamicroneme protein 4 N，rEtMIC4N)，所以克隆EtMIC4N基因，与已发表的基因序列比较，构建真核表达载体pPICZαA/EtMIC4N，利用毕赤酵母(Pichiapastoris)表达rEtMIC4N，为后续其免疫原性研究打基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，北京农学院病理实验室保存。

pGEM-T克隆载体、表达载体pPICZαA、大肠杆菌JM109、毕赤酵母GS115、Trizol为Invitrogen公司产品，M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Oligo(dT)15、Rnasin、DNA胶回收试剂盒为TaKaRa产品。

1.2 方 法

1.2.1 EtMIC4N特异性片段的克隆和序列分析 Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊分离总RNA，根据Genebank设计柔嫩艾美耳球虫微线蛋白4基因N端(EtMIC4N)引物[7]，进行RT-PCR扩增、克隆、测序和序列分析。

1.2.2 重组表达载体pPICZαA/EtMIC4N构建 EtMIC4N片段与pPICZαA连接，构建重组表达载体pPICZαA/EtMIC4N，转入大肠杆菌，生长菌落即为疑似阳性菌落，提取质粒，PCR鉴定，验证pPICZαA/EtMIC4N构建成功与否。

1.2.3 毕赤酵母的电转化及阳性菌株的筛选 将构建好的重组表达载体、空表达载体电转入感受态毕赤酵母，在100 μg/mL含Zeocin的YPD固体培养基培养，凡生长菌落即是疑似菌落，用AOX通用引物进行PCR鉴定。

1.2.4 rEtMIC4N的小规模表达筛选及鉴定 试验分为3组：空载体转化毕赤酵母甲醇诱导对照组、重组载体转化毕赤酵母未用甲醇诱导对照组和重组载体转化毕赤酵母甲醇诱导表达组，对这3组进行rEtMIC4N的小规模表达。

收集空载体转化毕赤酵母甲醇诱导对照组第2天的上清和重组载体转化毕赤酵母未用甲醇诱导对照组第36小时的上清各1 mL为对照；分别收集重组载体转化毕赤酵母甲醇诱导表达组第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清各1 mL进行SDS-PAGE电泳、硝酸银染色鉴定。收集重组载体转化毕赤酵母甲醇诱导表达组第3天的上清1 mL，进行Western blot鉴定。

1.2.5 rEtMIC4N的大规模表达及纯化 以摇瓶的方式对重组载体转化的毕赤酵母甲醇诱导，进行大规模表达，离心收集第3天的150 mL的培养上清，超滤除盐后浓缩为5 mL，先流经Ni-NTA柱，再通过250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱，以柱容积为单位分别收集洗脱液，利用分光光度计在OD280对重组蛋白进行测定，然后进行SDS-PAGE电泳、硝酸银染色和Western blot鉴定。

2 结 果

2.1 EtMIC4N特异性片段的克隆和序列分析

EtMIC4N特异性片段的克隆后得到773 bp的EtMIC4N特异性片段(图1)。EtMIC4N基因序列经Blast分析显示，克隆序列与Genebank中EtMIC4N的1 004～1 766 bp序列基本吻合，与开放阅读框保持一致，其中4个碱基发生突变和1个Gap，基因相似度99.5%。在蛋白水平上，与Genebank的EtMIC4N蛋白比较，有4个氨基酸发生突变，相似度为98%。

2.2 重组表达载体pPICZαA/EtMIC4N构建与鉴定

经连接成功的重组表达载体pPICZαA/EtMIC4N转染大肠杆菌JM109，挑取白色单菌落LLB/Zeocin液体培养，提取质粒、PCR扩增，扩增出与预期大小一致的目的条带，说明重组表达载体pPICZαA/EtMIC4N构建成功，见图2。

2.3 毕赤酵母的电转化及阳性菌株的筛选

提取JM109感受态细胞中PICZαA/EtMIC4N重组质粒，电转毕赤酵母，涂布于含Zeocin的YPD平板，对菌落进行PCR鉴定，电泳结果显示预期的目的条带(图3)，证明转化成功，且为阳性重组毕赤酵母。

2.4 rEtMIC4N的小规模表达筛选及鉴定

SDS-PAGE显示，重组载体转化毕赤酵母甲醇诱导表达组第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清中约45 kD的位置出现弥散状的条带，而空载体转化毕赤酵母甲醇诱导对照组和重组载体转化毕赤酵母未用甲醇诱导对照组的上清中均没有此条带(图4)，Western Blot分析显示，表达的蛋白大小为45 kD(图5)，说明rEtMIC4N是由甲醇诱导重组表达载体转化的毕赤酵母产生的。SDS-PAGE和Western Blot的结果一致，说明45 kD的条带为分泌表达的rEtMIC4N。

2.5 rEtMIC4N的大规模表达及纯化

大规模表达浓缩液经Ni-NTA柱洗脱，收集的洗脱液经SDS-PAGE，在45 kD处出现单一条带，且主要是被第2个柱容积的洗脱液洗脱下来(图6)。纯化后的蛋白经Western Blot鉴定，条带同SDS-PAGE结果一致，但在80 kD的位置还出现一个条带(图7)。通过OD280对蛋白进行测定，每升的酵母发酵液3 d能够表达大约为10 mg的rEtMIC4N。

3 讨 论

目前的抗原筛选研究与自然条件下球虫感染鸡的免疫途径并不相同，在自然条件下，艾美耳球虫主要引起的是细胞免疫应答，如果能建立一种鸡肠道细胞模型，用细胞免疫的水平来筛选有效的抗原，再用细胞免疫的途径对鸡进行免疫来预防艾美耳球虫病，此研究思路可望在艾美耳球虫病的预防方面获得突破性的进展[7]。而真核表达的抗原更为接近天然结构，这对抗原的有效筛选有着重要的意义。

JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4的全序列，发现EtMIC4与巨型艾美耳球虫TFP250蛋白有较高的同源性，而与刚地弓形虫翻译起始位点的一致，说明EtMIC4的起始密码子同样在Kozol序列中[8]。对EtMIC4的内含子和外显子分析，发现其内含子还有剪接的保守序列[9-10]。经过系统发生树的分析，EtMIC4和TF250的TSP-1结构域与TgMIC12的遗传距离较远[11]。EtMIC4基因的进化祖先可能含有连续的TSP-1外显子区域，通过内含子的重组和进化，最后形成艾美耳属的MIC4。EGF样结构域之间含有大量的内含子，说明EGF的多拷贝进化要早于TSP-1。这与缺少内含子的EGF样结构域的层黏蛋白在进化上的结果一致[12-13]。本研究发现诱导表达rEtMIC4时，蛋白条带银染的结果灰度分析显示第1天到第2天未发现可见条带，说明前2 d表达量较少，3～6 d差异不大，所以在大规模诱导表达时，选择在第3天回收上清。

CHEN等[14]表达乳铁蛋白相关抗菌多肽时，发现表达产物比预期的分子量大。王鑫等[15]表达猪β-防御素也出现相似现象。本试验中rEtMIC4N的基因序列和表达载体的标签序列组成的重组蛋白分子量大小为29 kD，毕赤酵母分泌表达的蛋白约为45 kD，比预测的分子量要大。其原因可能是由于rEtMIC4是一个重复结构域的蛋白，导致其蛋白的折叠等高级结构发生变化，也可能是由于rEtMIC4N的糖基化作用，使分子量增大，但其具体原因尚待进一步研究。

SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色结果显示在62 kD到83 kD之间未出现条带，但经Western Blot检测，在这个位置有轻微的条带，说明重组蛋白有微量的出现，这可能是表达的rEtMIC4N形成少量二聚体，被灵敏度较高的Western Blot检测出。

EtMIC4蛋白分子量较大，较难整体重组表达，需分段进行。rEtMIC4C是C端重组蛋白，rEtMIC4N是N端蛋白。DANFORTH等[16]对rEtMIC4C的免疫原性进行研究，证明rEtMIC4C对鸡预防球虫同源感染有一定效果。DU等[6]研究发现，人参皂苷与原核表达的rEtMIC4C联合免疫鸡，能够部分抵抗柔嫩艾美耳球虫的攻击，且发现rEtMIC4C沙门氏菌载体疫苗对鸡同源艾美耳球虫攻击的保护作用[17]。JAVIER等[4]获得EtMIC4的全长序列后，还未见对其新发现的N端序列进行表达和免疫原性的研究。本试验成功对rEtMIC4N进行毕赤酵母表达及鉴定，并获得一定量纯度较高的蛋白，摇瓶发酵的表达量可达到10 mg/L，至于其免疫原性及临床应用前景值得进一步探索。