板栗栗疫病抗性QTL定位

王泽华，聂兴华，张 煜，郝雅琼，李伊然，张 卿， 张铁强，王广鹏，秦 岭，邢 宇*

(1.北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206； 2.河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北昌黎 066600)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是中国重要的经济林树种之一，已有6 000多年栽培历史[1]。中国板栗品种丰富，分布范围广泛。板栗在生产栽培过程中，会受到栗疫病的危害，影响板栗产量。栗疫病是一种由栗疫病菌引起的真菌性病害[2]，主要危害板栗枝干，其最适生长温度为25～28 ℃[3]。1904年，在美国纽约动物园的美洲栗上首次发现栗疫病[4]。在随后不到半个世纪的时间内该病几乎摧毁了全境的美洲栗树[5]。随后在欧洲意大利、法国等地陆续发现栗疫病[6-8]。在中国部分地区也发现栗疫病。目前，栗疫病已成为危害栗属植物的一种全球性病害。

解决栗疫病最有效途径是选育抗病品种，而筛选抗性强的种质资源和解析栗疫病的抗病遗传机制对抗病育种有重要的指导作用。在栗疫病抗性评价方面，中国板栗一直被认为是对栗疫病抗性最强的一个种[9]。中国板栗栗疫病抗性基因是选育抗病品种的重要基础。秦岭等[10]从中国北方板栗21个品种(类型)中选出北峪2号、兴隆城9号、野生板栗、渤海所18、燕魁和短花栗等7个抗性品种(类型)；HUANG等[11]从中国13个传统板栗品种中筛选出叶里藏、红光和晚薄壳3个抗性品种，为生产上选用抗栗疫病品种资源及抗栗疫病亲本选择提供参考。

在栗疫病抗性基因挖掘方面，前人进行大量研究。已有证据表明中国栗树对栗疫病的抗性是由2个不连锁的共显性基因控制[12]；KUBISIAK等[13]鉴定出与栗疫病相关的3个抗性区段，其中2个抗性区段与桃中的白粉病抗性相关；通过对美国和中国板栗的转录组分析比较，已经鉴定几种可能参与栗疫病防御反应的基因[14-15]；在欧洲，亚洲和欧洲板栗之间的种间杂交已经产生对栗疫病具有一定程度抗性的杂交种[16-17]；同时，XING等[18]发布中国板栗基因组；JI等[19]构建中国板栗高密度遗传图谱，为今后中国板栗栗疫病抗性研究提供一定基础。

为进一步挖掘中国板栗栗疫病抗病数量性状位点，本研究选用河北省昌黎果树研究所栽培的‘燕山早丰’与‘燕晶’及其正反交群体。对该杂交群体175个F1代进行栗疫病接种试验并对抗病数量性状位点进行初定位，鉴定板栗栗疫病抗病数量性状位点。

1 材料与方法

1.1 试验材料育种

以河北省农林科学院昌黎果树研究所杂交育种圃栽培的‘燕山早丰’与‘燕晶’及其正反交群体为试材，共选用175个F1代，其中‘燕山早丰’一年生枝条接种栗疫病菌后病斑面积为51 mm2；‘燕晶’一年生枝条接种栗疫病菌后病斑面积72 mm2。试验材料选择在田间已栽培7年的成熟板栗树体，随机选取3根结果母枝上长约30 cm、直径约10 mm的一年生枝条，随后进行离体抗性评价。

1.2 供试菌株与菌株培养

供试菌株为‘EP155’(CryphonectriaparasiticaEP155)，菌落橘黄色的野生型强毒力菌株，保存于北京农学院植物科学技术学院秦岭课题组(图1)。

将活化EP155菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar，PDA)培养，放置于28 ℃恒温培养箱，光照16 h/d条件下培养。

1.3 枝条离体接种

采用枝条离体接种[20]。将接种枝条进行酒精消毒后吹干，用长6 mm、宽2 mm的打孔器在枝条上按一定间距打3个孔，要求孔能够见木质部。用直径6 mm的打孔器挑取在28 ℃恒温培养箱中培养3 d的供试菌株，用于离体枝条接种。同时用未接菌的PDA培养基接种枝条，设置对照。每个子代重复3次，在接种完成后将枝条平放在铺有湿润吸水纸的托盘上，放入温度28 ℃、湿度60%、光照16 h/d的培养箱中培养。

接种后每隔1 d观测一次枝条发病情况，测量记录病斑长度、宽度，观察病斑扩展速率。调查持续4 d。

1.4 数据统计与分析

根据病斑长度、宽度计算出枝条发病面积，对枝条发病面积进行抗性分级；将杂交群体离体接种枝条的病斑面积用Excel整理，把其改为*qua文件格式保存。结合秦岭课题组已发表的中国板栗高密度遗传图谱[19]，以区间作图法(Interval Mapping, IM)进行栗疫病抗性相关基因的数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)定位。

2 结果与分析

2.1 杂交群体抗性分级

栗疫病菌接种杂交群体4 d后，枝条平均溃疡面积呈连续变异且频数分布符合正态分布趋势(图2)，有利于栗疫病抗性基因QTL分析。根据接种后离体枝条的溃疡面积，将杂交群体分为5级。第I级38个子代，平均溃疡面积33～48 mm2；第II级68个子代，平均溃疡面积48～63 mm2；第III级42个子代，平均溃疡面积63～78 mm2；第IV级26个子代，平均溃疡面积78～93 mm2；第V级1个子代，平均溃疡面积93～107 mm2；将第I级定为抗病子代、第III级定为中抗子代，第V级定为易感子代(图3)。

2.2 杂交群体栗疫病抗性QTL定位

根据杂交群体的栗疫病抗性鉴定结果，结合北京农学院秦岭课题组已发表的板栗高密度遗传图谱[19]，利用区间作图法，对抗病QTL的位置和效应进行分析(表1和图4)。共检测到13个栗疫病抗性QTL，分布在LG1、LG5、LG6、LG7和LG11连锁群上，单个QTL的贡献率为6.4%～12.0%。其中，np1010、lm1157和hk52的贡献率较高，分别为12.0%、8.3%、8.1%，这3个位点可能是板栗栗疫病抗性基因的关键位点。

表1 基于区间作图法鉴定的中国板栗栗疫病抗性QTLTab.1 QTL for resistance to chestnut blight by IM mapping

3 讨 论

人们对栗疫病的研究集中在病菌的侵染循环、遗传结构、毒力分化方面[21]。黄宗安[22]在锥栗栗疫病的研究中发现，树皮中多酚类物质、黄酮类化合物、木质素含量以及多酚氧化酶活性等物质与锥栗栗疫病抗性相关；STATON等[23]筛选到15个可能与栗疫病抗性相关基因。近年来，植物免疫调控研究取得一系列研究进展[24-25]。越来越多的抗病机制被发现，比如激酶通过磷酸化反应在生物信号转导过程中发挥重要作用，目前已报道多种受体激酶或受体蛋白参与植物免疫信号的识别和激活[26]；XING等[18]发布中国板栗基因组；这些研究进展都将促进栗疫病抗病育种的进程。

利用遗传连锁图谱进行数量性状QTL定位在果树分子育种中有很重要的作用。姚玉新等[27]利用苹果品种‘东光’和‘富士’的正反交F1群体，获得与果实酸度基因Ma相连锁的分子标记SDY085；梨树上，MONTANARI等[28]对‘PEAR3’בMoonglow’F1群体抗枯萎病性状进行QTL分析，在父本LG2上发现一个主效QTL位点；YUAN等[29]利用2个宽皮橘杂交的F1群体对柑橘果皮果肉的色差值进行QTL定位得到一些候选区间。本研究利用‘燕山早丰’与‘燕晶’杂交后代进行栗疫病抗性QTL定位，挖掘与栗疫病抗性紧密连锁的分子标记，为栗疫病抗病分子标记辅助选择育种奠定一定理论基础。本研究选用一年生枝条作抗病评价材料，评价1年的数据，这些因素可能会影响抗病QTL定位结果。

本研究在JI等[19]遗传图谱第1连锁群、第5连锁群、第6连锁群、第7连锁群、第11连锁群上鉴定到栗疫病抗性QTL位点，通过与已发表的栗疫病抗性QTL位点进行比较，发现本研究鉴定到的第6连锁群与KUBISIAK等[13]定位的Cbr2位点重合。