右美托咪定对血管性认知障碍大鼠学习记忆的改善作用

韦颂禧，王红磊，韦红巧

(1. 前海人寿广西医院麻醉科，广西 南宁 530200；2. 广西医科大学基础医学院生理学教研室，广西 南宁 530021)

由脑血管病及其危险因素所引起的临床卒中或者亚临床血管性脑损伤，并至少涉及一个认知域受损害的临床综合征，称为血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)[1]。VCI被认为是痴呆的第二大最常见原因[2]。VCI 虽然是迄今为止唯一可有效防治的痴呆类型，但其防治仍然无理想药物，因此寻找安全有效的药物尤为重要。右美托咪定是广泛应用于临床麻醉的一种新型麻醉药品，研究表明其在多种脑损伤中发挥神经保护作用，可改善认知功能障碍和减少术后认知功能障碍的发生率[3-5]。但关于右美托咪定对VCI的作用及相关研究甚少，本研究旨在探讨右美托咪定对VCI的改善作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 30只SD大鼠、SPF级、雄性，体重为(255±15) g，由广西医科大学实验动物中心提供。合格证号：SCXK(桂)2003-0003。盐酸右美托咪定注射液(扬子江药业集团有限公司生产)，SOD、MDA和GSH-Px试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司Solarbio)，IL-6、IL-1β、TNF-α试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司CUSABIO)，TUNEL试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2动物分组及VCI大鼠模型制备 将30只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和右美托咪定组，每组10只。通过永久结扎大鼠双侧颈总动脉建立VCI大鼠模型：大鼠称重后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定，常规备皮消毒，沿颈顶正中线切开皮肤，分离双侧颈总动脉，用1号丝线双重结扎(结扎远近端)，并从中间剪断颈总动脉，最后皮肤缝合并消毒，待大鼠苏醒后，放回笼中进行常规饲养。假手术组不结扎双侧颈总动脉，其余手术过程相同。术后死亡的大鼠被剔除出本研究，并补足相应的大鼠数目。通过Morris水迷宫检测大鼠的认知功能是否损害，而判断VCI模型建立是否成功。

1.3药物治疗 各组大鼠在温度和湿度可控动物房内正常饲养28 d后，右美托咪定组大鼠按20 μg/kg腹腔注射右美托咪定，模型组及假手术组给予等量生理盐水腹腔注射，1次/天，连续给药14 d。

1.4大鼠学习与记忆能力的检测 末次给药12 h后采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习和记忆能力。正式检测前，先让大鼠适应环境。定位航行实验：将不透明平台(直径10 cm)放置于西北象限中心，低于水面1.5 cm处，分别从4个不同象限将大鼠面朝壁池放入水，记录大鼠找到平台的时间(即逃避潜伏期)。若120 s内大鼠未找到平台，由实验者引导其至平台上并停留20 s，逃避潜伏期记录为120 s。将4个不同象限入水的逃避潜伏期求出平均值，记为当天的检测结果，作为空间学习能力的成绩。测试历时5 d，每天训练1次。空间探索实验：定位航行试验结束24 h后，撤除站台，大鼠从原平台所在象限的对侧象限入水，记录大鼠首次穿越平台区域的时间(逃避潜伏期)和120 s内穿过原平台所在位置的次数。

1.5脑组织MDA的含量及SOD、GSH-Px活性测定 Morris水迷宫实验结束后，麻醉大鼠，快速断头，低温取全脑，分离双侧皮质和海马。取左侧皮质称重，按试剂盒要求制成10%的匀浆，ELISA法检测脑组织中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6脑组织中炎症因子的检测 取海马组织称重，按试剂盒要求制成10%的匀浆，采用ELISA法检测大鼠海马组织匀浆液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7HE染色 Morris水迷宫实验结束后，经心脏灌注0.9%生理盐水及4%多聚甲醛后断头取脑。分离海马和皮质，放置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片、脱水后，行HE染色，光镜下观察皮质、海马部位病理学改变。

1.8TUNEL染色检测细胞凋亡 取常规石蜡切片，然后按TUNEL检测试剂盒说明书进行操作。光学显微镜下每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)观察计数，以细胞核呈棕褐色为TUNEL阳性细胞，取阳性细胞率进行统计学分析。

2 结果

2.1右美托咪定对VCI大鼠学习记忆能力的影响 Morris水迷宫行为学实验分为定位航行实验和空间探索实验，目的是为了判断空间的学习和记忆能力。定位航行实验的结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期在第2～5天明显延长(P<0.001)；与模型组比较，右美托咪定组大鼠第2～5天的逃避潜伏期均有所缩短(P<0.001)。空间探索实验的结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期延长且穿越原平台的次数明显减少(P<0.001)；与模型组比较，右美托咪定组大鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.001)、穿越原平台的次数增多(P<0.001)。见表1、表2。

表1 3组大鼠定位航行实验的逃避潜伏期比较 单位：s

表2 3组大鼠空间探求实验结果

2.2右美托咪定对VCI大鼠脑组织MDA含量、SOD、GSH-Px活性变化的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中MDA的含量增加(P<0.01)，同时SOD和GSH-Px的活性下降(P<0.01)；右美托咪定组大鼠脑组织中MDA含量下降，而SOD和GSH-Px的活性增加，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，见表3。

表3 3组大鼠脑组织MDA含量、SOD及GSH-Px酶活性比较

2.3右美托咪定对VCI大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α的含量的影响 与假手术组比较，模型组的大鼠脑组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均升高(P<0.01)；给药14 d后，与模型组比较，右美托咪定组大鼠的脑组织中中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均下降(P<0.01)，见表4。

表4 3组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量比较 单位：pg·ml-1

2.4右美托咪定对VCI大鼠脑组织病理学改变的影响 假手术组大鼠的皮质、海马的神经细胞形态正常，核圆润，核染色质均匀清楚，海马的神经元排列整齐，细胞间隙正常；模型组大鼠皮质、海马的神经细胞核固缩、浓染甚至破裂，部分细胞出现坏死、消失，海马的神经元排列紊乱稀疏，组织间隙肿胀；给药14 d后，与模型组比较，右美托咪定组大鼠皮质、海马的神经细胞形态改善，细胞核固缩程度减小，坏死细胞数量减少，海马的神经元排列整齐，见图1。

注：A为假手术组皮质，B为模型组皮质，C为右美美托咪定组皮质，D为假手术组海马，E为模型组海马，F为右美托咪定组海马。

2.5右美托咪定对VCI大鼠脑组织细胞凋亡的影响 通过光镜观察，可见凋亡细胞(阳性细胞)呈棕褐色，而阴性细胞呈紫色。模型组大鼠皮质及海马的神经元凋亡较假手术组增加(P<0.001)；但给药14 d后，右美托咪定组大鼠皮质及海马的神经元凋亡较模型组下降(P<0.001)，见图2。

注：a：与假手术组比较，P<0.001；b：与模型组比较，P<0.001。

3 讨论

VCI发病机制复杂，氧化应激、炎症反应、线粒体的损伤及细胞凋亡等在VCI的病理生理过程中起重要作用[6-8]。当组织缺血缺氧可诱发氧化应激反应、炎症反应等导致的神经元损伤、死亡，尤其海马、皮质等重要功能区域的损伤，从而导致学习记忆障碍[9-11]。多项研究表明[12-14]，通过抑制脑组织的氧化应激和炎症反应及调节凋亡相关蛋白的表达抑制神经细胞凋亡的发生，均可以改善VCI所致的大鼠学习记忆障碍。

大量的临床及实验研究表明，右美托咪定对多种脑损伤具有神经保护的作用，其已知的神经保护作用机制包括：抑制炎症反应、抗氧化应激、抑制细胞凋亡及抗兴奋性神经毒性等[15]。但右美托咪定是否对VCI具有保护作用及改善其认知功能少见相关的研究报道。因此，本实验通过建立VCI大鼠模型，观察右美托咪定对VCI大鼠的学习和记忆能力的影响，并探讨其相关机制。

永久结扎大鼠双侧颈总动脉导致慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)模型是研究VCI的经典动物模型，其能较好地模拟人慢性脑血流灌注不足造成的脑组织处于低灌注和低氧状态，从而引起海马、皮质等重要功能区域的损伤，使大鼠的学习能力及记忆力降低[16-17]。故本实验采用此方法建立VCI大鼠模型。经Morris水迷宫检测发现，在定位巡航实验中模型组大鼠的逃避潜伏期较假手术组明显延长，在之后的空间探索实验中与假手术组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期延长、穿越原平台的次数明显减少，提示大鼠的空间学习和记忆能力出现认知功能障碍，说明本实验VCI大鼠模型建立成功。脑内生化指标检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均升高，SOD和GSH-Px 水平显著减少，而MDA 含量显著增加，提示VCI大鼠脑组织存在有炎症反应增强和氧化应激。此外，模型组大鼠的皮质及海马神经细胞凋亡率较假手术组增加，VCI大鼠脑组织的神经细胞凋亡增强。以上结果表明，氧化应激、炎症反应及细胞凋亡参与了VCI的病理生理过程，导致认知功能障碍的发生，与文献[11，18]报道一致。

经过连续14 d腹腔注射给予右美托咪定后，本实验结果显示，与模型组比较，右美托咪定组大鼠Morris水迷宫的逃避潜伏期缩短而穿越原平台的次数增多，提示VCI大鼠的空间学习和记忆能力得到了改善，说明右美托咪定可以改善VCI大鼠的学习记忆功能；与模型组比较，大鼠的脑组织中中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA的含量均下降，而SOD和GSH-Px的活性增加，表明右美托咪定可以抑制VCI大鼠的炎症反应和氧化应激，增强机体抗氧化能力，从而对VCI大鼠有神经保护作用。此外，右美托咪定组大鼠皮质及海马的神经细胞凋亡率较模型组显著下降，皮质及海马神经细胞的病理损伤明显减轻，说明右美托咪定可以抑制VCI大鼠脑组织的神经细胞凋亡，减轻脑组织损伤，维护神经元网络结构的完整性，进而改善VCI大鼠的学习记忆障碍。

综上所述，右美托咪定对VCI大鼠的学习记忆有改善作用，其机制可能与抑制炎症反应、抗氧化应激和减轻细胞凋亡有关，但具体的作用机制有待于进一步研究。