VPS33B对卵巢癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究

旷思思，石丽云，廖秀琼

(深圳市人民医院计划生育科，广东 深圳 518028)

卵巢癌是目前临床上较为常见的一种女性生殖系统恶性肿瘤，其发病早期具有极强的隐匿性，绝大多数患者一经确诊便已是中晚期，丧失了手术根治的时机，预后不良[1-2]。故此，探索卵巢的早期诊断新手段以及有效的新疗法具有极其重要的意义，亦是提高卵巢癌患者生存周期的重中之重。VPS33B基因英文官方名称为Vacuolar protein sorting 33 homologB(yeast)，该基因主要编码蛋白空泡蛋白分选蛋白33B，上述蛋白是Secl/Munc-18(SM)蛋白家族成员之一[3]，既往临床上关于VPS33B基因的报道主要集中在关节挛缩以及肾功能不全等方面，尚无关于该基因在肿瘤发病机制方面的研究报道。随着近年来相关研究的日益深入，越来越多的学者发现VPS33B基因在肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中均存在异常表达，可能是潜在的癌症相关基因之一，有望成为卵巢癌治疗的潜在靶点[4-5]。鉴于此，本文通过研究VPS33B对卵巢癌细胞增殖凋亡的影响及机制，旨在为卵巢癌的诊治提供新的思路和靶点，现报告如下。

1 对象与方法

1.1材料：人卵巢癌OVACA-3细胞购自美国ATCC细胞库；RPMI1640培养基以及胎牛血清均购自美国Hyclone公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技有限公司；蛋白裂解液RIPA以及蛋白酶抑制剂PMSF均购自碧云天公司；PI3K、AKT、c-Myc单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology；VPS33B多克隆抗体购自Proteintech公司；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；稳定过度表达的VPS33B慢病毒购自锐博公司；特异性针对VPS33B的RNA干扰片段购自广州锐博公司。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2研究方法

1.2.1构建过表达VPS33B的OVACA-3细胞株：采用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5%CO2条件下实施传代培养，待细胞生长状态良好时实施慢病毒转染。取OVACA-3细胞以D-hanks洗涤3次，加入胰酶消化1～2 min，取适量培养基种植消化，800 r/min离心处理2 min后去除上清液，加入全培吹散细胞至单细胞悬液。取5 000个细胞置入24孔板内，加入500μl全培，混匀，8 h后细胞贴壁后，计算各试剂所需剂量，进行过度表达VPS33B的慢病毒转染，6～8 h后换液，持续培养48 h。

1.2.2干扰VPS33B过表达组卵巢癌OVACA-3细胞株转染siRNA靶向干扰VPS33B过表达处理：严格遵循siRNA转染试剂说明书相关操作步骤，将干扰片段si-VPS33B离心后用150μl DEPC水溶解配置成终浓度为20 μmol/L的工作液，放置在-80℃冰箱中保存备用。取生长至90%～95%的融合度的OVACA-3细胞，采用D-hanks洗涤3次，加入胰酶消化2 min，取适量培养基种植消化，800 r/min离心处理2 min后去除上清液，加入全陪吹散细胞至单细胞悬液。于6孔板内各孔分别接种2×105个细胞，接种8～12 h后，待细胞贴壁，且密度达至40%～60%汇合度时进行转染。

1.2.3细胞增殖测定：主要是通过四甲基偶氮唑(MTT)法进行测定，具体操作如下：首先取处于对数生长期的OVACA-3细胞接种在96孔板内，于37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后无血清培养24 h。分别测定过表达VPS33B、转染siRNA靶向干扰VPS33B过表达以及未经处理的OVACA-3细胞，测定570 nm吸光度值。每次各组均设置5个复孔，实验重复3次，以平均值作为最终结果。

1.2.4细胞凋亡检测：通过Annexin V-FITC流式细胞技术进行检测。将处于对数生长期的细胞接种在直径60 mm的培养皿中，贴壁后在无血清状态下培养，一应操作严格参照细胞凋亡测定试剂盒说明书完成，每组重复3次，以平均值作为最终结果。

1.2.5PI3K、AKT、c-Myc蛋白浓度检测：采用Westernblot法实现，首先在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，同时加入2 ml的培养基，将转染处理后的细胞置入EP管内，并与胰蛋白提取液根据1∶100比例混合，冷冻10 min，促使细胞完全裂变为E溶液。于EP管内以1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 ml，促使细胞完全裂变为F溶液。将E与F溶液按照80∶1的体积混匀，放置在37.5℃保温相中20 min，冷却后计算PI3K、AKT、c-Myc蛋白浓度。

1.3观察指标：对比三组OVACA-3细胞增殖情况，三组OVACA-3细胞转染48 h后凋亡情况以及三组OVACA-3细胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表达水平。

2 结果

2.1三组OVACA-3细胞增殖情况评价：过表达VPS33B组OVACA-3细胞增殖能力低于OVACA-3对照组和干扰VPS33B过表达组，且干扰VPS33B过表达组OVACA-3细胞增殖能力高于OVACA-3对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 三组OVACA-3细胞增殖情况评价

2.2三组OVACA-3细胞转染48 h后凋亡情况评价：过表达VPS33B组OVACA-3细胞转染48 h后活细胞占比低于OVACA-3对照组和干扰VPS33B过表达组，凋亡细胞、坏死细胞占比高于OVACA-3对照组和干扰VPS33B过表达组；且干扰VPS33B过表达组OVACA-3细胞转染48 h后活细胞占比高于OVACA-3对照组，凋亡细胞、坏死细胞占比低于OVACA-3对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 三组OVACA-3细胞转染48h后凋亡情况评价

2.3三组OVACA-3细胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表达水平评价：过表达VPS33B组PI3K、AKT、c-Myc蛋白表达明显低于OVACA-3对照组以及干扰VPS33B过表达组，且干扰VPS33B过表达组PI3K、AKT、c-Myc蛋白表达均高于OVACA-3对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图1～3。

图1 三组细胞中PI3K蛋白表达水平变化，依次为干扰VPS33B过表达组、OVACA-3对照组、过表达VPS33B组

图2 三组细胞中AKT蛋白表达水平变化，依次为干扰VPS33B过表达组、OVACA-3对照组、过表达VPS33B组

图3 三组细胞中c-Myc蛋白表达水平变化，依次为干扰VPS33B过表达组、OVACA-3对照组、过表达VPS33B组

3 讨论

迄今为止，关于卵巢癌的具体病因以及发病机制尚未完全明确，可能与环境、内分泌激素、遗传、晚婚晚育等因素密切相关[6-8]。由于卵巢癌患者发病早期往往缺乏特异性症状，发现时往往已处于晚期阶段，易出现肿瘤灶的转移，临床治疗主要以手术联合化疗等综合疗法为主，但效果并不十分理想，严重威胁女性生命健康安全[9-10]。因此，探寻与卵巢癌发生、发展密切相关的基因，可为卵巢癌发病机制奠定基础，进一步为临床诊治方案的制定提供参考依据。相关研究报道显示，在肿瘤的发生、发展过程中，多种基因均会发生异常改变，且长期处于该状态下会影响细胞生长以及分化，从而为肿瘤的发生、发展创造有利条件[11-13]。VPS33B基因主要定位于人15号染色体q26.1上，其所编码的蛋白在蛋白排序功能调控中起着至关重要的作用[14]。由此可见，该基因表达可能与细胞增殖、凋亡存在密切相关，其具体作用机制值得临床深入研究，可能为卵巢癌的治疗提供理论依据。

本研究结果发现，VPS33B对卵巢癌细胞增殖具有一定的抑制作用，同时对卵巢癌细胞凋亡具有促进作用。这提示了VPS33B基因可能在卵巢癌的发生、发展过程中扮演着抑癌基因的角色。考虑原因可能在于过表达VPS33B基因有效阻滞了细胞周期进程，从而促使细胞周期G1期朝S期转化出现障碍，继而导致细胞周期被阻滞在G1期，最终影响细胞增殖、分化。同时，VPS33B可能与NESG1在卵巢癌发生、发展过程中起着协同抑癌的作用，可能是通过调控可特异性结合DNA区域并调控基因转录的蛋白分子表达，继而干扰该类基因和相互作用的转录因子形成复合体，从而调控基因转录以及转录后翻译。近年来，PI3K/AKT/c-Myc信号通路是众多学者关注的热点，其可在多种细胞内表达，进一步介导细胞的增殖以及分化。且有相关研究报道[15-17]证实，PI3K/AKT/c-Myc信号通路的活化可促进淋巴血管的形成以及肿瘤细胞增殖，继而促使病情朝不可控方向发展。作为机体内的重要信号通路，PI3K活性增强可调控下游抗氧化蛋白，继而促使机体受活性氧的损害，发生氧化应激反应，导致卵巢癌细胞的氧化以及抗氧化平衡被打破，最终刺激了卵巢癌细胞的增殖[18-20]。而本研究结果发现：过表达VPS33B组PI3K、AKT、c-Myc蛋白相对表达量明显低于OVACA-3对照组以及干扰VPS33B过表达组，且干扰VPS33B过表达组PI3K、AKT、c-Myc蛋白相对表达量均高于OVACA-3对照组。这也提示了VPS33B对卵巢癌细胞增殖凋亡的影响机制可能与抑制PI3K/AKT/c-Myc信号通路活化有关，值得后续进一步关注。

综上所述，VPS33B可发挥明显的抑制卵巢癌细胞增殖作用，同时对卵巢癌细胞凋亡具有促进作用，其可能作用机制是抑制PI3K/AKT/c-Myc信号通路活性，值得进一步研究。