BoBs技术在有超声软指标的高龄孕妇产前诊断中的应用

陈希敏，汪雪雁，尹雁，叶梦玲，秦胜芳，席娜

(四川省妇幼保健院医学遗传与产前诊断科，四川 成都 610045)

0 引言

由于国家二胎政策的放开，高龄孕产妇的数目也随之大大增加。高龄孕妇是指孕妇年龄或其孕产年龄≥35岁[1]。染色体疾病是遗传性疾病的常见类型，是出生缺陷的常见病因。有文献报道，在我国新生儿中，染色体疾病大约占6%左右，此外，高龄孕妇所怀胎儿的染色体异常率会有所增高，而且随着孕妇的年龄的增长，其染色体异常率会明显地增高[2-4]。胎儿超声软指标是指孕妇在接受超声检查时所发现的一大类非特异性的胎儿的结构的微小变化，大多为一过性的，并且在正常胎儿中也可见，但是其在具有染色体异常的胎儿中的发生率会明显增高，因此，其在评估胎儿是否存在染色体异常上具有重大价值[5]。随着超声技术的发展进步，胎儿超声软指标检出率也逐渐增高，因此，越来越多的医生将其纳入产前诊断的指征。

目前，运用于临床上产前诊断的方法种类较多，常见的有细胞遗传学的染色体核型分析技术，分子遗传学的荧光原位杂交技术(FISH)，荧光定量聚合酶链式反应(QF-PCR)，细菌人工染色体标记-微球鉴别/分离法(BoBs)，染色体微阵列分析(CMA)等[3，6-8]，然而传统的细胞遗传学的细胞染色体核型分析技术依旧是作为产前诊断的金标准[9]，但其存在分辨率有限，发放报告周期长，经验要求高，可能出现培养失败等缺点。FISH需要设计特定的探针，通量低。QF-PCR无法检测诊断染色体的嵌合体情况以及染色体的微缺失/微重复。而CMA的检测费用较昂贵，并且对于临床意义未知(VOUS)的拷贝数变异(CNV)的临床解释有一定困难，增加孕妇的心理负担。近些年新出的BoBs技术，不需要进行细胞培养，检测周期短，检测通量较高，而且可以同时检测常见的染色体的非整倍体异常以及九种常见的微缺失综合征[8,10]。本研究运用BoBs检测结合细胞染色体核型分析技术对225例羊水细胞标本进行产前诊断，探索分析BoBs技术对有超声软指标的高龄孕妇产前诊断的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至2020年10月于我院医学遗传与产前诊断科就诊的225例有超声软指标的高龄孕妇且拒绝染色体微阵列分析检测的作为研究对象，孕周为18+2-32+1周，年龄为34-44岁，并且均为单胎妊娠。所有孕妇术前均签署了产前诊断相关的知情同意书。

1.2 研究方法

羊膜腔穿刺常规腹部消毒铺巾后，临床医生在超声引导下，经腹壁行羊膜腔穿刺术，抽取30mL羊水，分别置于4支无菌离心管内，其中20mL羊水分两线独立操作进行羊水细胞培养用作染色体核型分析，另外5mL羊水用作产前BoBs检测分析，最后5mL羊水经离心后，将其细胞沉淀置于-80℃冰箱保存备用。

染色体核型分析将2支15mL无菌离心管内的羊水于1500rpm离心6min，然后由两名实验室人员分两线分别将羊水细胞沉淀接种于2个细胞培养瓶内，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，然后依次经过换液、秋水仙素作用、胰酶消化处理细胞、滴片制备、G显带染色，每个羊水标本计数20个细胞分裂象，分析其中的3-5个细胞染色体核型，若分析到染色体异常或者存在多态性，则增加计数至50个细胞分裂象，并且要增加细胞染色体核型分析数量。按照人类细胞遗传学国际命名标准2009(ISCN2009)进行结果描述、出具报告。

BoBs检测取5mL羊水于2000rpm离心10min，弃上清液，留取细胞沉淀，按照DNA提取试剂盒(Qiagen，美国)说明书操作步骤提取羊水细胞基因组DNA，用Nanodrop(Thermo，美国)检测所提取DNA的浓度和纯度，然后按照BACs-on-BeadsTM Assay试剂盒(Perkin Elmer，芬兰)说明书操作步骤进行BoBs检测，依次包括DNA标记，纯化，杂交，洗涤，报告分子结合，Luminex 200(Luminex，美国)读取数据，最后使用BoBsoft软件分析结果。BoBs技术检测范围及探针分布见表1。

表1 BoBs技术检测范围及其探针设计分布

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.4 观察指标

随访对本研究中所有研究对象运用门诊联合电话沟通的方法进行随访妊娠结局，以便掌握孕妇以及胎儿的具体情况。

2 结果

2.1 胎儿超声软指标异常情况

225例孕妇共检查出10种胎儿超声软指标异常，并且均为单项超声软指标异常，具体见表2。

表2 胎儿超声软指标异常情况

2.2 染色体核型分析

225例羊水标本中，出现1例培养失败(孕32+1周)，成功率为99.56%(224/225)。共检测出染色体异常12例(5.36%，12/224)，其中染色体数目异常5例(41.67%，5/12)，染色体结构异常5例(41.67%，5/12)，嵌合体2例(16.66%，2/12)。检测到的染色体数目异常包括21-三体2例(40.00%，2/5)，性染色体数目异常3例(1例47，XXY，2例47，XYY)(60.00%，3/5)。检测到的染色体结构异常包括1例(20.00%，1/5)罗伯逊易位，核型为45，XN，rob(13；14)(q10；q10)，3例(60.00%，3/5)平衡易位，核型分别为46，XN，t(1；13)(q12；q14)、46，XN，t(5；8)(p13；p23)和46，XN，t(4；15) (q35；q12)，1例(20.00%，1/5)倒位，核型为46，XN，inv(20) (p13q13.1)。检测到的2例染色体嵌合体核型分别为46，XN(45)/47，XN，+21(5)和45，X(7)/46，XY(43)。此外，还检出染色体多态性2例(0.89%，2/224)，核型分别为46，XN，1qh+和46，XN，22ps+。不同超声软指标，胎儿染色体核型异常检出率不同，其中以NT增厚为穿刺指征的胎儿染色体核型异常检出率最高(5例)，然后依次为鼻骨缺失、侧脑室增宽及单脐动脉(2例)，肾盂分离(1例)。见表3。

表3 不同超声软指标异常与染色体异常结果统计情况

2.3 BoBs检测

225例羊水标本均成功完成检测，成功率为100%。BoBs检测技术共检测出染色体异常6例(2.67%，6/225)，其中染色体数目异常5例(83.33%，5/6)，染色体结构异常1例(16.67%，1/6)。染色体数目异常包括21-三体2例(40.00%，2/5)，性染色体数目异常3例(1例XXY，2例XYY) (60.00%，3/5)。染色体结构异常为1例微缺失综合征，即DiGeorge综合征Ⅰ型(22q11.2微缺失)。见图1。不同超声软指标，BoBs异常检出率也不同，其中以NT增厚、鼻骨缺失异常检出率最高(2例)，其次为三尖瓣轻度返流、单脐动脉(1例)。见表3。

图1 BoBs检测异常结果A,B,C,D分别为XXY，XYY，21-三体和DiGeorge综合征Ⅰ型

2.4 BoBs检测技术和细胞染色体核型分析技术的结果对比

在本研究中，BoBs检测漏诊了染色体平衡易位3例、罗伯逊易位1例、染色体倒位1例、染色体嵌合体2例及染色体多态性2例。染色体核型分析漏诊了1例微缺失综合征(DiGeorge综合征Ⅰ型)。对比胎儿染色体异常检出率，BoBs检测(2.67%，6/225)要低于染色体核型分析(5.36%，12/224)，两者差异具有统计学意义(χ2=4.754，P＜0.0005)。见表4。

表4 两种检测方法异常结果对比及妊娠结局

2.5 随访

在孕妇领取检测报告后，对所有孕妇采取电话和门诊相结合的方法随访其妊娠结局，其中2例21-三体综合征、1例克氏综合征、2例染色体嵌合体以及1例染色体微缺失胎儿随即终止妊娠，其他孕妇均继续妊娠。见表4。

3 讨论

通过中国出生缺陷防治报告(2012)报道表明，目前我国的出生缺陷总的发生率大概在5.6%左右，而且每年新增加的出生缺陷数目大约有九十万例左右，并且有研究表明染色体异常可能是导致出生缺陷发生的较常见原因之一[11]。随着社会发展，现代女性推迟生育，加之国家“全面二孩”政策的调整，高龄孕妇比例激增，高龄孕妇由于配子质量下降，发生出生缺陷的风险也增大[12]。胎儿超声软指标是超声检查时常见的胎儿结构细微改变，上世纪便开始用于临床，且在染色体异常胎儿中出现率较高[13]。本研究显示，不同超声软指标，不同产前诊断检测方法，胎儿染色体异常检出率存在差异。

本研究中共有225例孕妇进行产前诊断，其中染色体核型分析出现1例培养失败，原因是由于孕妇孕周过大(孕32+1周)，导致羊水细胞无法贴壁生长，培养成功率为99.56%，共检测出染色体异常12例，异常检出率为5.36%。与BoBs检测对比，漏检1例微缺失综合征，是由于染色体核型分析分辨率有限，难以检出小于5-10 Mb的染色体异常[14]。BoBs检测成功率为100%，共计检测出染色体异常6例，异常检出率为2.67%，与其他研究者的研究结果吻合[15]。与染色体核型分析对比，对于5对常见的染色体(13、18、21、X和Y)的非整倍体诊断，二者结果一致，但是未能检出染色体平衡易位、罗伯逊易位、倒位及染色体多态性，是由于BoBs技术无法检测染色体平衡性重排，超出其检测范围导致。对于染色体嵌合体的诊断，BoBs检测漏检2例。有研究报道，产前BoBs检测可检出嵌合比例低至20%-40%的样本[16]。本研究中，由于染色体嵌合比例较低，导致漏检，可见BoBs技术对嵌合体诊断能力有限。此外，本研究中，BoBs技术检出1例微缺失综合征，检出率低于李怡梅等[14]研究结果，可能和样本量少有一定关系。BoBs检测技术结合细胞染色体核型分析技术，可以较好地提高染色体的异常检出率，和国内其他研究者的研究结果一致[17,18]。

本研究中，2例21-三体综合征、1例克氏综合征、2例染色体嵌合体以及1例染色体微缺失胎儿，经遗传咨询后，随即终止妊娠。而染色体平衡易位、罗伯逊易位、倒位及染色体多态性的胎儿，通过夫妻双方染色体验证分析，其均遗传自临床表型正常的父母，经过临床遗传咨询后，这些孕妇均选择继续妊娠。此外，2例超雄综合征胎儿，经遗传咨询，慎重考虑后，选择继续妊娠。其他未检出染色体异常胎儿均继续妊娠。

与产前诊断“金标准”染色体核型分析相比，BoBs技术具有快速诊断、通量高、无需细胞培养、结果易于判读及可检测染色体微缺失/微重复等优点，但是也存在其局限性，如无法检测到探针未覆盖的区域、倍性变化、甲基化、点突变、平衡性重排、单亲二倍体及某些染色体嵌合体等。二者具有一定的互补作用，BoBs检测技术结合细胞染色体核型分析技术，能够使得产前诊断的准确性得到提高，避免医疗纠纷，降低出生缺陷，具有较高的临床应用价值，值得推广。