YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

谢永丽，汤华

（天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津 300070）

肝细胞癌（HCC）是人类主要恶性肿瘤之一，死亡率排名全球第4位。而乙型肝炎病毒（HBV）感染是引发HCC的主要危险因素，占全球HCC病例的一半以上。因此，迫切需要更好地了解HBV导致HCC的分子机制以及找到新型治疗靶点。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中发生的最丰富的修饰。研究表明，m6A在病毒和疾病发生、发展过程中起重要作用。虽然YTHDF1（YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1）已经被报道与卵巢癌抗癌免疫疗法[1]和海马依赖性学习及记忆[2]等有关，但其在HBV相关肝癌中的作用研究尚少。

本研究通过分子克隆机制构建了过表达和敲降YTHDF1质粒，探讨YTHDF1对HBV编码蛋白表达的影响和对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人正常肝细胞L02、肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15细胞，均购买自ATCC细胞库，并为本实验室液氮保存。胎牛血清（FBS）、DMEM、MEM-α培养基、Opti-MEM培养基均购自美国GIBCO BRL。Lipofectamine2000购自Invitrogen。所有抗体、cDNA均购自中国天津赛尔生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养L02细胞、Huh7细胞用含有10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素以及100 IU/mL青霉素的DMEM培养基培养。HepG2.2.15细胞用含有15%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺以及200 μg/mL G 418的MEM-α培养基培养。上述细胞均培养在含5%CO2、37℃的细胞培养箱中。

1.2.2 过表达YTHDF1质粒的构建 用YTHDF1 cDNA作为模板进行PCR，PCR循环体系如下：预变性95℃4 min；变性94℃1 min，退火55℃30 s，延伸72℃2 min，进行“变性-退火-延伸”循环33次；延伸72℃10 min。回收大小约为1.67 kb的PCR产物。对pCD3/Flag-KBE质粒和PCR产物进行酶切，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ,回收大小约为5.6kb和1.67 kb酶切产物。然后连接，铺板，小提鉴定，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ，将条带正确的质粒送测序。

1.2.3 敲降YTHDF1质粒的构建 首先针对YTHDF1 mRNA设计合成编码shRNA的DNA单链，引物序列如表1，然后将其在95℃条件下退火5 min,室温条件下静置2 h，和用BamHⅠ和HindⅢ酶切好的pSilencer2.1-U6 neo质粒进行连接，铺板，小提鉴定（酶切位点为EcoRⅠ和XhoⅠ）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.4 转染（脂质体法）在Huh7细胞中，将HBV蛋白质粒与pSilencer2.1-U6 neo、pshR-YTHDF1质粒共同转染，每组两个质粒分别各转0.5 μg，将质粒和Lipofectamine2000按照1 μg：1 μL比例分别加入到无血清Opti-MEM培养基中，室温静置5 min，然后将Lipofectamine2000管加入到质粒管中，室温静置20 min，最后加入到细胞板中。转染6 h换液，48 h收取蛋白样品进行后续实验。

1.2.5 ELISA实验的转染（脂质体法）在HepG2.2.15细胞中转染过表达、敲降YTHDF1及其对照质粒。在Huh7细胞中转染过表达、敲降YTHDF1及其对照质粒的同时，共同过表达pHBV1.3质粒，在L02细胞中转染过表达YTHDF1及其对照质粒的同时，共同过表达pHBV1.3质粒，每孔质粒共1 μg。转染方法同1.2.4。48、72 h分别收取600 μL上清进行后续实验。

1.2.6 Western印迹实验 用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液收取蛋白样品，加入5×loading buffer，100℃加热5 min，然后冰置5 min。用10%SDS-PAGE胶分离蛋白（蛋白上样量为30 μL），将蛋白转移到PVDF膜上。室温条件下用5%脱脂牛奶封闭2 h，裁剪PVDF膜，分别用相应的抗体孵育过夜。用TBST漂洗孵育一抗的PVDF膜，加入相应的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗孵育二抗的PVDF膜，用Western LightningTM化学发光试剂作用2 min，然后进入暗室中用感光胶片曝光，等胶片完全晾干，分析结果并拍照。

1.2.7 ELISA检测分泌HBsAg和HBeAg的抗原 根据ELISA试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理 实验均重复3次，使用Image J软件、Graph Pad Prism6.0软件处理实验数据，数据均表示±s，组间比较采用双侧Studentt检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western印迹检测YTHDF1的表达 如图1所示，与正常肝细胞L02相比，HBV阴性肝癌细胞Huh7细胞和HBV阳性肝癌细胞HepG2.2.15细胞中YTHDF1的表达分别增加4倍和7倍，YTHDF1在HBV阳性肝癌细胞HepG2.2.15细胞中的表达是HBV阴性肝癌细胞Huh7细胞的1.5倍（t=17.4、39.6、8.4，均P＜0.05）。

图1 Western印迹检测YTHDF1在不同细胞中的表达Fig 1 The expression of YTHDF1 in different cells detected by western blotting assay

2.2 YTHDF1过表达质粒的构建 用YTHDF1 cDNA作为模板，YTHDF1-295-BamHI、YTHDF1-1971-XhoI作为上下游进行PCR，产生大小约为1.67 kb的条带（图2A）。对pCD3/Flag-KBE质粒和PCR产物进行酶切，产生大小为5.6 kb和1.67 kb的条带（图2B）。最后进行酶切鉴定，挑选同时有5.6 kb和1.67 kb两条条带的2号质粒送测序（图2C）。将测序结果序列和NCBI序列比对。测序结果正确后，质粒转染Huh7细胞后第3天，制备细胞裂解物，用Flag抗体进行检测，确定了YTHDF1在细胞中表达（图2D）。

图2 pCD3/Flag-YTHDF1质粒的构建与鉴定Fig 2 Construction and validation ofplasmidpCD3/Flag-YTHDF1

2.3 YTHDF1敲降质粒的构建 将pSilencer2.1-U6 neo质粒进行酶切，产生大小为5.6 kb的条带（图3A），小提酶切鉴定挑选同时有大小为5.6 kb和0.37 kb两条条带的质粒10号送测序（图3B）。测序结果与设计的引物比对，测序结果正确后，质粒转染Huh7细胞后第3天，制备细胞裂解物，用YTHDF1抗体进行Western印迹实验验证pshR-YTHDF1质粒有效（图3C）。

图3 pshR-YTHDF1质粒的构建与鉴定Fig 3 Construction and identification of plasmid pshR-YTHDF1

2.4 敲降YTHDF1后HBV编码蛋白的表达水平 首先验证了HBV编码蛋白质粒的有效性（图4A），其次Western印迹检测敲降YTHDF1后，HBV编码蛋白表达水平的变化（图4B）。结果显示，敲降YTHDF1后，HBV基因组编码HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）均降低（均P＜0.05）。

图4 Western印迹检测Huh7细胞中pshR-YTHDF1对HBV编码蛋白的影响Fig 4 The effect of pshR-YTHDF1 on HBV-encoded proteins in Huh7 cell dctected by western blotting assay

2.5 ELISA检测过表达和敲降YTHDF1对HBsAg和HBeAg抗原分泌的影响 与对照组相比，转染pHBV1.3质粒组分泌的HBeAg抗原在48 h（t=118.4）和72 h（t=28.7）分别增加8倍和6倍（图5A），差异均有统计学意义（均P＜0.01）。在Huh7细胞中，过表达YTHDF1时，HBsAg（t48h=5.5，t72h=5.0）和HBeAg抗原（t48h=5.7，t72h=6.3）表达水平增加，敲降YTHDF1时，HBsAg（t48h=16.0，t72h=7.9）和HBeAg抗原（t48h=9.0，t72h=14.3）表达水平降低（图5B、C）。在HepG2.2.15细胞中，过表达YTHDF1时，HBsAg（t48h=5.3，t72h=27.4）和HBeAg抗原（t48h=29.0，t72h=6.6）表达水平增加，敲降YTHDF1时，HBsAg（t48h=22.3，t72h=7.0）和HBeAg抗原（t48h=8.1，t72h=6.6）表达水平降低（图5D、E），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而在正常肝细胞L02中过表达YTHDF1时，HBsAg（t48h=4.0，t72h=2.0）、HBeAg（t48h=3.5，t72h=1.8）抗原表达水平没有增加，差异没有统计学意义（图5F、G）。

图5 ELISA检测HBsAg和HBeAg抗原的分泌Fig 5 ELISA for the detection of HBsAg and HBeAg antigen secretion

3 讨论

HCC已成为全世界普遍存在的公共卫生问题。HBV是引起HCC的主要危险因素。HBV的当前治疗方法包括干扰素和核苷酸类似物拉米夫定[3-4]、阿德福韦、恩替卡韦[5]、替比夫定、替诺福韦[6]以及最近获得FDA批准的替诺福韦阿拉芬酰胺。核苷酸类似物进行抗HBV治疗，可以有效抑制病毒的复制，但不能根除肝细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA）。然而，在不根除cccDNA的情况下，即使通过抗病毒治疗实现了功能性治愈，HBV仍然继续存在诱发肝癌发展的风险，特别是对于已经发展为肝硬化的患者[7]。治疗性疫苗旨在通过引发新的抗病毒反应来增强免疫力，这些疫苗可能无法诱导功能性治愈，因为它们的效力不足以诱导HBV特异性T细胞。由于目前缺乏有效的干预措施，所以对HCC发生的分子机制的了解至关重要。

m6A可以调节细胞RNA生物学的许多方面[8-9]，这主要取决于m6A读码器[10]。多项研究指出，肝细胞损伤可能是由HBV复制和病毒产物的积累引起的[11]。而且HCC的发生与m6A RNA甲基化调节蛋白的异常表达有关[12-17]。此外，YTHDF1在调控HCC细胞的细胞周期和代谢方面也发挥着重要作用。因为已有文献指出，YTHDF2和YTHDF3可以调节HBV的生命周期[18]，耗尽YTHDF2或YTHDF3会显著增加HBs蛋白和HBc蛋白的表达。所以在这里笔者集中研究YTHDF1对HBV的影响，其中包括HBV编码的蛋白水平和细胞分泌的抗原表达水平。

本研究中，笔者确定YTHDF1在肝癌细胞中高表达。然后构建了过表达和敲降YTHDF1质粒。HBV编码的蛋白中HBc蛋白和HBs蛋白分别构成病毒衣壳和包膜，HBV DNA Pol蛋白在体内和体外都促进肝癌细胞的迁移、侵袭能力，HBx不构成病毒体的一部分，起转录反式激活的作用。HBV病毒蛋白可以影响病毒和宿主基因的表达。所以笔者首先研究YTHDF1对HBV病毒蛋白的影响。敲降YTHDF1后，HBV基因组编码的蛋白表达降低。HBsAg表明机体被病毒感染，HBeAg表明病毒的传染性、病毒的复制和肝脏损害程度。当HBsAg和HBeAg同时表达时表明感染严重。所以本实验证明YTHDF1促进了HBsAg和HBeAg抗原的分泌。而在低表达的L02细胞中，过表达YTHDF1对HBsAg和HBeAg抗原的分泌没有影响。

综上所述，YTHDF1在肝癌细胞中可以促进HBV编码蛋白的表达和HBsAg、HBeAg抗原分泌，所以YTHDF1可能在HBV感染中起重要作用。由于其对HBV DNA Pol蛋白表达的影响最大，所以后续的研究可能是YTHDF1影响HBV DNA Pol蛋白表达的具体分子机制。本研究为阐明m6A修饰调节HBV编码蛋白的表达提供新理论依据，也具有潜在的临床应用意义。