浙粟3号的EMS诱变条件筛选

石丽敏 吕学高 朱正梅 宋费玲 卢华兵

（浙江省农业科学院玉米与特色旱粮研究所 东阳322100）

粟米（Setaria italic L.），北方俗称谷子，原产于我国，是最古老的作物之一，去壳后是小米[1]。在禾谷类作物中，粟米的营养价值最高而且营养相对平衡，不仅含有丰富的蛋白质(9%～16%)、脂肪(3%～7%)、淀粉，还含有多种氨基酸、维生素和矿质元素[2]，能够满足人体生理代谢较多方面的需要，调节人们的膳食营养结构，随着人们物质生活水平的不断提高，小米也受到越来越多的消费者喜爱。谷子具有耐贫瘠、耐干旱、抗逆性强等特性，尤其适合在山区干旱地区种植[3]。在浙江很多地方都有种植粟米的传统习惯，浙粟3号是浙江省农业科学院玉米与特色旱粮研究所从地方种中优选纯化所育成的适合浙江地区种植的粟米品种，是高产优质的糯小米类型，缺点就是株高偏高，易倒伏[4]。笔者希望能够利用诱变手段创制出矮秆突变体材料，对其进行株高改良。甲基磺酸乙酯（Ethylmethan sulfonate，EMS）诱变是一种简便高效且应用最广泛的方法，能够诱发DNA分子发生点突变，不易对染色体造成畸变，稳定性好，而且相较于其他诱变方式，EMS诱变成本低廉、操作简便、重复性高，因而被广泛用于突变体的创造，成为种质资源创新和基础研究获取突变体材料的一种有效手段[5-6]。目前EMS诱变已成功地应用于玉米[7-8]、水稻[9-11]、小麦[11-13]、大豆[14-15]等多种作物的突变体材料创制与育种上，在谷子上应用EMS诱变创造突变体材料虽然起步较晚，但是也有一些报道[3,16]。但由于不同的材料对EMS诱变剂的敏感性不同，其半致死剂量也存在显著差异，因此针对不同的材料确定其适宜的处理条件是化学诱变工作中关键的一步。本试验以不同预处理方式、EMS浓度及处理时间处理浙粟3号，以确定EMS处理浙粟3号的适宜条件，提高诱变效率，为获得更多浙粟3号突变体材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

浙粟3号种子由浙江省农业科学院玉米与特色旱粮研究所提供，试验用种子经过精挑细选，确保每粒饱满。

1.2 化学试剂

1.2.1 EMS原液 甲基磺酸乙酯，纯度＞99%，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 磷酸缓冲液 1 000 mL的磷酸缓冲液配方为6.8 g磷酸氢二钾和291 mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液，再加蒸馏水稀释至1 000 mL,调节pH至7。

1.2.3 不同浓度（体积百分数）的EMS溶液 用pH为7的磷酸缓冲液作为EMS的稀释剂，配制不同浓度的EMS溶液，以0.4%EMS溶液配制为例，用移液枪吸取EMS原液400μL，加入磷酸缓冲液定容至100 mL，摇晃均匀即配制完成，需现配现用。

1.3 试验方法

试验采用正交设计法，因素A为种子预处理，设3个水平分别为不浸泡的干种子、清水浸种12 h过夜和磷酸缓冲液浸种12 h过夜。因素B为不同EMS浓度（体积百分数）处理，设5个水平，EMS浓度依次为0.4%、0.8%、1.0%、1.2%和1.5%。处理C为EMS诱导时间，设4个水平，分别为浸泡处理2 h、4 h、6 h和8 h，共60个处理组合。处理过程在TS-100C恒温摇床上进行，温度设置20℃，振荡速度100 r/min。EMS处理完后，立即将种子取出于流水下冲洗30 s，然后每个处理挑选100粒饱满种子放置于铺有滤纸的培养皿中（滤纸预先用清水浸透），设2次重复，将培养皿置于光照培养箱中，设置温度26℃，每日光照16 h，每日下午补清水1次。7 d后调查发芽率。

1.4 数据统计与分析

种子发芽率（%）=发芽种子数÷测定样品种子数×100%。利用统计分析软件DPSS 19.0对统计数据进行多因素方差分析和邓肯氏（Duncan）多重比较。

2 结果与分析

通过对预处理方式、EMS浓度、处理时间3个主体对因变量种子发芽率的效应的检验表明（表1），预处理方式、EMS浓度和处理时间均对种子发芽率影响极显著（P值即Sig值<0.01）。

表1 预处理方式、EMS浓度、处理时间对种子发芽率影响的方差分析结果（主体间效应的检验）

2.1 预处理方式对种子发芽率的影响

结合表2和图1可知，3种预处理方式中，除了1.0%EMS浓度处理2 h清水浸种和干种子发芽率相同外，清水浸种种子发芽率最高，磷酸缓冲液浸种种子发芽率最低。经过多重比较分析表明，清水浸种处理与干种子、磷酸缓冲液浸种处理种子发芽率差异极显著，干种子与磷酸缓冲液浸种处理种子发芽率无显著差异。且3种方式预处理后，种子发芽率都随着EMS浓度增加和处理时间延长整体呈降低趋势。

2.2 EMS浓度对种子发芽率的影响

以不浸种干种子为例，结合图1和表2可以看出，当EMS浓度低于1.0%时，随着EMS浓度增加，种子发芽率逐渐降低；当EMS浓度高于1.0%，处理时间分别为2 h和4 h，种子发芽率呈现先升高再降低的趋势，处理时间分别为6 h和8 h，种子发芽率呈较平稳下降趋势。经过多重比较分析表明，除了EMS浓度1.0%与1.2%之间种子发芽率差异不显著外，其他几个浓度间种子发芽率差异都极显著，说明种子发芽率随着EMS浓度的增加总体呈下降趋势不变。

图1 不同预处理方式对种子发芽率的影响

2.3 EMS处理时间对种子发芽率的影响

由表2和图2可知，随着EMS处理时间的增长，不同预处理及不同EMS浓度处理种子发芽率都是逐渐降低的。多重比较分析结果表明不同处理时间之间种子发芽率差异极显著。

图2 各因素影响下种子发芽率变化趋势

表2 不同处理下种子的发芽率（%）

3 讨论

近年来，EMS被广泛用于多种作物诱变育种和突变体库构建，种子经EMS处理后的致死效应最先表现在种子发芽率，播种后会继续表现为成苗率、生长量等指标的降低及组织器官等形态的改变。产生这些效应的基础是研究材料中细胞水平和分子水平的诱变效应，包括细胞分裂受抑制、生长点分生组织细胞受损伤、生长素受破坏、染色体变异及遗传物质核酸和一系列生物大分子蛋白质在结构上的变化等[18]。因此，选择合适的诱变剂量是诱变研究中获得较高突变频率、构建理想突变体库的关键，本研究中把半致死剂量即种子发芽率的50%作为标准来筛选适宜的诱变条件[19-21]。诱变条件的确定是构建一个成功突变体库的重要前提[17]，也是突变体材料创制的第一步。EMS能够抑制种子的萌发，不同的EMS处理条件对种子的发芽率影响不同，发芽率又能间接反映诱变效果，研究结果表明，预处理方式、EMS浓度、处理时间均对种子发芽率影响极显著，无论是低浓度或是高浓度的EMS溶液处理浙粟3号种子，种子萌发能力均受到抑制作用，且随着EMS浓度的增大、处理时间的延长，抑制作用随之增强，与前人研究结果一致。

EMS处理不同植物的最佳条件是不同的，例如黄瓜品种SK-1最适的EMS诱变条件为2.1%EMS浸种12 h[22]，高粱品种BTx623最佳的EMS诱变条件是0.2%EMS浸种20 h[23]，花生品种中花5号的EMS最佳诱变条件是0.9%EMS浸种7 h，或者1.2%EMS浸种5 h[18]。EMS处理同一植物不同品种的最佳条件也是不同的，目前已有报道的几个谷子品种的最佳诱变条件也各不相同，豫谷1号的最佳诱变条件为种子清水浸种过夜，1.0%EMS处理8 h[24];晋谷21的最佳诱变条件是将提前清水浸过的种子用1.0%EMS处理10 h[25]，十里香的最佳诱变条件是用浓度1.2%EMS处理16 h[17]。以半致死量为标准，本研究确定了浙粟3号种子的最佳诱变条件：干种子，用浓度0.4%EMS处理4 h。

李伟等[24]研究结果表明，在相同浓度EMS处理下，清水浸泡过夜的谷子种子较未浸泡的发芽率低，认为在相同浓度、相同处理时间下使用清水浸种过夜，能够更好地发挥EMS的作用，使EMS能较快 地渗入种子胚中。宋振君等[17]发现用1×PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）提前浸种6.5 h后，在相同浓度EMS处理下，未提前浸种的十里香种子较浸种的种子的发芽势和发芽率均降低。本研究同时表明清水浸种、磷酸缓冲液浸种和不浸种在相同浓度EMS处理下，清水浸种发芽率显著高于不浸种的种子发芽率，而不浸种与缓冲液浸种对种子发芽率影响差异不显著，与前人研究结果不同。根据试验结果推测，使用清水浸种过夜，种子充分吸水，根据渗透势原理，相当于稀释了EMS浓度，种子所受到的伤害显著少于相同浓度、相同处理时间下的其他种子。