肿瘤相关巨噬细胞和幽门螺杆菌感染在各部位Ⅲ期胃腺癌患者预后中的意义

王月洁，魏枫，任秀宝,2

（天津医科大学肿瘤医院1.生物技术研究室；2.生物治疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室，天津 300060）

胃癌是世界上第五大常见癌症和全球第三大癌症死亡原因[1]，腺癌占胃恶性肿瘤的95%以上[2]，进展期患者的5年生存率仅为7%～27%[3]，其中胃底贲门癌处于胃食管交界部，近年来较胃体癌和胃窦癌发生率有所上升[4]，且术后复发相对较多，患者预后差，严重影响患者的生活质量[5]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)是胃癌肿瘤微环境的重要组成部分。越来越多的研究关注胃癌的炎性微环境在胃癌发生、发展中的作用[6]。研究发现TAMs与不良预后密切相关，但亦有研究表明TAMs与预后呈正相关[7]。也有研究显示，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）相关Tip α蛋白经激活核因子κB，诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α等炎症因子，促进肿瘤的发生、发展[8]，同时Hp感染在胃癌中可调控TAMs极化[9]。然而，Hp感染和TAMs结合起来讨论与不同部位胃腺癌的预后关系尚未阐明。因此，本研究旨在分析不同部位Ⅲ期胃腺癌组织中的TAMs相关标志物（CD68和CD163）和是否感染Hp，以探讨Hp感染和TAMs与不同部位的Ⅲ期胃腺癌患者预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年1月—2014年12月就诊于天津医科大学肿瘤医院胃部肿瘤科经病理确诊为Ⅲ期胃腺癌的病理组织石蜡标本。其中男223例，女77例；年龄范围27～83岁，平均（59.78±11.04）岁。分期采用最新的国际抗癌联盟（International Union Against Cancer，UICC）和美国抗癌联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版TNM分期。纳入标准：（1）年龄20～85岁。（2）无远处转移。（3）手术切缘镜下阴性。（4）诊断确切。（5）临床分期为Ⅲ期。（6）病例信息完备。排除标准：（1）术前接受除手术外的抗癌治疗者。（2）合并第二原发性肿瘤者。（3）失访者。共收集到符合要求的研究对象300例。其中胃底贲门癌100例、胃体癌100例和胃窦癌100例。本研究得到天津医科大学肿瘤医院伦理委员会批准，标本取材经家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 鼠源单克隆抗CD68抗体购于美国Thermo Fisher公司；兔源单克隆抗CD163抗体购于美国Abcam公司；鼠源单克隆抗CD66b抗体购于美国BioLegend公司；鼠源单克隆抗Hp抗体购于迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂盒购于北京中衫金桥生物有限公司；二抗即酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购于迈新生物技术开发有限公司；生物显微镜（型号BX51TRF）购自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 所有组织标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，组织切片70℃烤箱烘烤1 h后，常规脱蜡，去离子水中浸泡复水15 min，用枸橼酸盐缓冲液高温高压修复3 min，自然晾至室温，3%H2O2封闭30 min，PBS冲洗5 min×3遍，加入稀释比例分别为CD68（1∶400）、CD163（1∶200）、CD66b（1∶100）、Hp（1∶100）于4℃冰箱孵育过夜。PBS洗5 min×3遍后，于室温孵育二抗（即用型免疫组化Elivision plus试剂）30 min，经DAB显色3～5 min，镜下（100×）观察染色情况，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片。免疫组化阳性标准：根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）。

1.3.2 免疫组化检测结果判定 所有指标的结果均由2位病理主治医师经双盲法判定。CD68和CD163阳性细胞计数：低倍（100×）下观察切片，选择阳性细胞分布最高密度区即“热点”，然后高倍（400×）下分别在癌巢（center of cancer tissues，CT）和癌巢浸润边缘（infiltrating edge of cancer nests，CI）计数5个视野的阳性细胞数，取其平均值为该例的CD68和CD163阳性细胞值，然后以中位数为截断值，分为高表达组和低表达组。将CD68阳性细胞在胃腺癌癌巢浸润边缘数量多于癌巢者定义为Ⅰ型胃腺癌，反之为Ⅱ型胃腺癌。CD66b阳性细胞计数：低倍（10×）下观察切片，选择中性粒细胞阳性细胞分布最高密度区，然后高倍（400×）下计数5个视野的阳性细胞数，取其平均值。然后以中位数为截断值，分为高表达组和低表达组。Hp结果判定：高倍（400×）下观察胃黏膜表面上皮与黏膜层之间和胃小凹，若观察到粗杆状、海鸥状菌体，部分呈颗粒和团块状，染色无棕黄色，则为阴性。

1.3.3 观察指标 计算患者CD68、CD163和CD66b阳性细胞数和Hp菌体数，观察其表达水平与临床病理特征的相关性以及与无病生存期（disease-free survival，DFS）、总生存期（overall survival，OS）的关系。

1.3.4 随访 随访开始于手术日，截止于2019年12月31日，以电话联系及定期复诊形式进行，中位随访时间为48个月，随访内容包括患者体重、精神状态、饮食、大小便的变化等。其中DFS定义为从手术日期到肿瘤复发或者是到最后1次随访的间隔时间。OS是指从手术日期到患者因肿瘤死亡或者到最后1次随访的间隔时间。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0、GraphPad Prism8进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布则以M（P25，P75）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关。绘制Kaplan-Meier生存曲线，截断值为中位数，采用Log-rank法比较生存率。Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料300例胃腺癌患者按照发病部位分为3组，3组的性别、年龄、癌胚抗原（CEA）、体重指数（BMI）、吸烟和淋巴结转移差异均无统计学意义。与胃体癌组比较，胃窦癌组饮酒者较多（t=6.742，P<0.05）；与胃底贲门癌组比较，胃窦癌组和胃体癌组肿瘤较小（χ2=5.972，P<0.05），见表1。

表1 3组患者一般资料比较[n(%），±s，M（IQR）]Tab 1 Comparison of basic characteristics among the three groups[n(%），±s，M（IQR）]

注：与胃底贲门癌组比较，aP＜0.05;与胃体癌组比较，bP＜0.05；CEA：癌胚抗原；BMI：体重指数

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2.2 CD68+TAMs和CD163+TAMs在不同部位胃腺癌组织中的表达情况CD68蛋白在巨噬细胞胞浆和胞膜呈阳性表达，呈棕褐色（图1）。CD163蛋白在M2型巨噬细胞胞浆和胞膜呈阳性表达，呈棕褐色（图2）。3个部位胃腺癌的TAMs空间分布不同，多在胃底贲门癌和胃体癌的癌巢浸润边缘和胃窦癌的癌巢分布。

2.3 CD68+TAMs和CD163+TAMs在不同部位胃腺癌组织中表达水平比较CD68+和CD163+TAMs在胃窦癌癌巢的相对表达水平高于癌巢浸润边缘；在胃底贲门癌癌巢浸润边缘的相对表达水平高于癌巢；在胃体癌癌巢浸润边缘的相对表达水平高于癌巢，差异有统计学意义（均P<0.01），见表2。

表2 3组患者CD68和CD163蛋白的表达[M（P25，P75）]Tab 2 Expressions of CD68 and CD163 proteins in three groups[M（P25，P75）]

2.4 CD68+TAMs与预后的相关性300例患者随访期均为5年，随访率为100%。CD68+TAMs在胃底贲门癌癌巢的浸润与预后呈正相关（rs=0.674，P=0.023），高计数组OS明显长于低计数组，差异有统计学意义，其他两个部位未见明显差别，CD68+TAMs高计数组在3个部位癌巢的5年累计总生存率分别为52.6%、44.1%和54.3%，5年累计无病生存率分别为25.7%、39.4%和44.9%；低计数组在3个部位癌巢的5年累计总生存率分别为33.3%、39.4%和36.7%，5年累计无病生存率分别为25.7%、29.6%和36.7%，见图3。CD68+TAMs在3个部位胃腺癌癌巢浸润边缘的浸润与预后呈负相关，低计数组OS均明显长于高计数组，在胃体癌癌巢浸润边缘低计数组DFS长于高计数组，差异有统计学意义，其他两个部位未见明显差异，CD68+TAMs高计数组在3个部位癌巢浸润边缘的5年累计总生存率分别为26.3%、34.7%和28.8%，5年累计无病生存率分别为25.0%、25.0%和34.6%；低计数组在3个部位癌巢的5年累计总生存率分别为55.6%、48.7%和45.1%，5年累计无病生存率分别为32.5%、42.5%和47.1%，见图4。

图3 不同部位胃腺癌癌巢的CD68蛋白表达与预后的关系Fig 3 Relationship between expression of CD68 protein in gastric adenocarcinoma nests at various sites and prognosis

图4 不同部位胃腺癌癌巢浸润边缘的CD68蛋白表达与预后的关系Fig 4 Relationship between expression of CD68 protein at the edge of gastric adenocarcinoma nest at the various sites and prognosis

2.5 CD163+TAMs与预后的相关性CD163+TAMs在胃体癌癌巢的浸润与预后呈正相关，高计数组DFS明显好于低计数组，差异有统计学意义，其他两个部位未见明显差别，CD163+TAMs高计数组在3个部位癌巢的5年累计总生存率分别为39.0%、42.1%和49.7%，5年累计无病生存率分别为31.1%、41.9%和43.5%；低计数组在3个部位癌巢的5年累计总生存率分别为34.7%、42.1%和33.1%，5年累计无病生存率分别为23.1%、26.1%和37.8%，见图5。CD163+TAMs在3个部位胃腺癌癌巢浸润边缘的浸润与预后呈负相关，低计数组OS均明显好于高计数组，在胃窦癌癌巢浸润边缘低计数组DFS好于高计数组，差异有统计学意义，其他两个部位未见明显差异，CD163+TAMs高计数组在3个部位癌巢浸润边缘的5年累计总生存率分别为20.4%、36.0%和33.1%，5年累计无病生存率分别为15.1%、23.2%和38.6%；低计数组在3个部位癌巢浸润边缘的5年累计总生存率分别为52.9%、48.0%和51.5%，5年累计无病生存率分别为41.2%、43.7%和44.2%，见图6。

图5 不同部位胃腺癌癌巢的CD163蛋白表达与预后的关系Fig 5 Relationship between expression of CD163 protein in gastric adenocarcinoma nest at various sites and prognosis

图6 不同部位胃腺癌癌巢浸润边缘的CD163蛋白表达与预后的关系Fig 6 Relationship between expression of CD163 protein at the edge of gastric adenocarcinoma nest at the various sites and prognosis

2.6 验证Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌与预后的相关性 不同部位的Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌的构成比例，见图7。Ⅱ型胃腺癌累计OS和DFS率明显高于Ⅰ型，差异有统计学意义，见图8。

图7 不同部位Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌构成比例Fig 7 Proportion of typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma atvarious sites

图8 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者生存曲线Fig 8 Survival curves of patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma

2.7 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp的分布情况和CD66b蛋白的表达Hp主要分布在胃黏膜表面上皮与黏膜层之间，贴近黏膜表面上皮细胞，可进入癌巢，胃小凹和黏膜浅层腺腔内亦可见Hp，免疫组化染色呈棕褐色，粗杆状、海鸥状，部分呈颗粒和团块状。CD66b阳性细胞染色呈棕褐色，多分布在癌巢间质，癌巢内也可见（图9）。Ⅰ型较Ⅱ型胃腺癌患者Hp阳性表达率低，差异有统计学意义（表3）。2.8Ⅰ型和Ⅱ型Hp阳性胃腺癌患者临床病理特点的分析 Ⅰ型胃腺癌患者Hp阳性率与发生部位有关，胃底贲门和胃体部阳性率更高（χ2=6.352，P<0.05），而与性别、年龄、BMI、有无吸烟饮酒、肿瘤大小、CEA、淋巴结转移无关；Ⅱ型胃腺癌患者Hp的阳性率在不饮酒者中更高（χ2=4.996，P<0.05），而与发生部位、性别、年龄、BMI、有无吸烟、肿瘤大小、CEA和淋巴结转移无关，见表4。

表3 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp的阳性表达率[n(%)]Tab 3 Hp positive rateof patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma[n(%)]

表4 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp阳性表达率与临床病理特点的关系[n(%)]Tab 4 The relationship between the positive rate of Hp and clinical parameters of patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma[n(%)]

2.9 Ⅰ型和Ⅱ型不同部位的Hp阳性胃腺癌患者与预后的相关性 肿瘤大小与年龄、发生部位有关系；分型与发生部位、中性粒细胞显著相关；Hp与发生部位、分型有关，见表5。单因素分析显示，在不同性别、年龄是否大于50岁、不同BMI、有无吸烟饮酒史、不同CEA、淋巴结是否转移、中性粒细胞不同水平间中位DFS差异无统计学，而发生部位在胃体和胃窦部、肿瘤直径＜4 cm、Ⅱ型、Hp阳性者中位DFS较长，生存质量较好（P＜0.05）；在发生部位、不同性别、年龄是否大于50岁、不同BMI、有无吸烟饮酒史、不同CEA间中位OS差异无统计学意义，而肿瘤直径＜4 cm、无淋巴结转移、Ⅱ型、Hp阳性、中性粒细胞高水平者的中位OS较长，生存质量较好（P＜0.05），见表6。多因素分析显示肿瘤大小、分型、Hp和中性粒细胞水平是胃腺癌的独立预后因素（P＜0.05），见表7。Ⅱ型Hp阳性胃体癌和胃窦癌患者的5年累积总生存率和无病生存率明显高于Ⅰ型Hp阴性（P＜0.05），见图10。

表5 各临床病理特征之间的相关性(r)Tab 5 Correlation between each clinical parameters(r)

表6 300例胃腺癌患者生存资料单因素分析Tab 6 Univariate analysis of prognosis factors in 300 patients with gastric adenocarcinoma

表7 300例胃腺癌患者生存资料的多因素分析Tab 7 Multivariate analysis of prognosis factors in 300 patients with gastric adenocarcinoma

注：OS：总生存期；DFS：无病生存期

3 讨论

宿主遭受损伤、炎症、感染和恶性肿瘤时，单核细胞从血液循环中招募出来，分化为组织巨噬细胞[10]。既往研究表明，CD68和CD163蛋白是最常见的TAMs标志物[11]。CD68作为泛巨噬细胞，CD163作为M2型巨噬细胞标志物，常被用于TAMs的评估和分类。但CD68＋和CD163＋TAMs在肿瘤微环境中的意义仍存在争议。CD68＋和CD163＋TAMs的浸润与食管癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌以及卵巢癌患者预后不良有关[12-16]。本研究行免疫组化染色示CD68＋和CD163＋TAMs在不同部位胃腺癌的表达并进行生存分析，发现CD68＋和CD163＋TAMs多在胃底贲门癌、胃体癌癌巢浸润边缘和胃窦癌癌巢表达，且它们在不同部位胃腺癌癌巢浸润边缘的表达水平与预后呈负相关，与上述研究结果一致。还发现各部位的Ⅱ型胃腺癌患者预后普遍好于Ⅰ型，上述结论得到验证。CD68＋和CD163＋TAMs在胃腺癌癌巢的高表达与预后呈正相关，虽然这一结果没有达到统计学差异，但可能预示着TAMs只有进入癌巢才能更好发挥吞噬肿瘤细胞的作用，今后需要扩大纳入病例对预后进行深入研究。

本研究结果显示Ⅱ型胃腺癌里胃窦癌占87%，猜想可能是Hp引起的这种现象，Hp破坏线粒体转录基因的调控，影响胃黏膜上皮细胞癌基因的转录平衡，但对T淋巴细胞的免疫平衡无影响。Hp定植于人的胃黏膜表面，机体对细菌产生免疫反应，导致免疫或炎症组织损伤。因此，人体内的免疫系统通过细菌与上皮的黏附而被激活，从而有效地将Hp抗原呈递给T细胞和B细胞，进而产生针对Hp的特异性细胞和体液免疫[17]。正常情况下，人体内的免疫系统具有完善的免疫监视功能。其中，抗原提呈细胞可识别、捕获、加工和呈递内源和外源抗原，诱导机体产生特异性的抗肿瘤和抗炎免疫反应，同时具有免疫调节功能。此外，还受到局部巨噬细胞、细胞因子和内毒素的影响和调节，与消化道炎症和肿瘤密切相关。这些结果表明，上述免疫功能改变在胃癌的发生、发展中起重要作用，但其潜在机制尚需进一步研究。

既往研究认为Hp感染可能会加速胃癌的进展[18]。笔者行免疫组化法染色Hp菌体并计数，发现Ⅱ型胃腺癌Hp阳性表达率高于Ⅰ型（P=0.039），单因素回归分析发现Hp阳性患者中位OS、DFS长于阴性且胃体癌和胃窦癌Ⅱ型胃腺癌Hp阳性患者预后最好，提示Hp感染可能通过影响TAMs浸润癌巢来改善肿瘤发展，此结果与杜金耀[9]不同，原因可能是本研究区分不同部位且严格控制同一临床分期，避免出现由于早期、晚期患者数量不均和不同部位胃腺癌患者预后本身存在差异。另外，胃底贲门癌的Ⅱ型患者太少无法进行预后分析，后期需要进一步扩大样本。

本研究还发现Ⅰ型胃腺癌患者感染Hp的数量与发生部位有关，胃底贲门和胃体部阳性率更高，可能原因：Ⅰ型胃窦癌为少数；Hp定植部位上移。Ⅱ型胃腺癌患者Hp的阳性表达率在不饮酒者中更高（P<0.05），是因为酒精有抵抗Hp的作用[19]。单因素回归分析发现肿瘤体积较小，中位OS、DFS较长，因为肿瘤体积的增加会压迫周围血管、神经，继而诱发其他病变，影响患者的生存时间。中性粒细胞高水平者的中位OS较长，这一结论与Zhang等[20]的观点一致。本研究发现Ⅱ型Hp阳性胃体癌和胃窦癌患者的生存时间明显高于Ⅰ型Hp阴性，推测可能是胃内Hp的感染促进TAMs向癌巢内浸润进而杀伤肿瘤细胞。

总之，本研究提示了肿瘤大小、TAMs的浸润分型和Hp是否感染可能是Ⅲ期胃腺癌的独立预后因素，不同部位的Ⅱ型胃腺癌的Hp感染可能促进TAMs的癌巢浸润，抑制肿瘤的发展速度，缓解患者的生存压力，但是具体机制需要后期更加深入的基础研究和临床研究来探讨Hp和TAMs之间的关系，为胃腺癌的治疗提供新的思路。