罗哌卡因通过线粒体通路诱导人结直肠癌SW620细胞株凋亡的实验研究

金晶玉朱成杰权英实黄学洙

(1.延边大学附属医院麻醉科,吉林 延吉 133002;2.延边大学附属医院重症监护科,吉林 延吉 133002)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见消化道肿瘤,可能与结肠炎症进展、饮食习惯、遗传等多种因素有关,发病率和死亡率较高[1]。CRC早期一般无特异性症状,就诊时大多已发展至肿瘤的中晚期,常规的手术切除治疗难以清除病灶组织,术后需要辅以放化疗来降低复发风险[2-3]。但长期大量使用化疗药物会杀伤机体正常细胞,引起骨髓抑制、肝肾毒性等,影响化疗效果[4]。寻找一种辅助治疗CRC的药物来抑制肿瘤的增殖促进其凋亡尤为重要。罗哌卡因是一类酰胺类的新型局部麻醉药,具有对心脏毒性小、麻醉时间长等优点[5]。Qin等[6]研究表明,罗哌卡因可以抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭及迁移,并促进其凋亡。高聪等[7]研究表明:罗哌卡因可以有效抑制结肠癌细胞增殖,但关于罗哌卡因诱导人结直肠SW620细胞株凋亡的机制研究尚不明确。因此本研究选择从线粒体通路途径探究罗哌卡因对人结直肠SW620细胞株凋亡的作用及可能的机制,旨在为CRC患者治疗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

结直肠SW620细胞株购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

青霉素和链霉素(北京索莱宝科技有限公司);RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Hyelone公司);Bcl-2抗体(货号:ab32124;批号:190807)、Bax抗体(货号:ab32503;批号:191011)、Caspase-3抗体(货号:ab13847;批号:190701)、Caspase-3抗体(货号:ab32539;批号:190904)购自美国Abcam公司。离心机(型号:TGL-16M,济南来宝医疗器械有限公司);流式细胞仪(型号:CytoFLE,美国贝克曼有限公司);细显微镜(型号:WMS-1037)购自上海无陌光学仪器有限公司;细胞培养箱(型号:ZSP-350S,上海左乐仪器有限公司);蛋白电泳及转膜仪及相关系统(美国伯乐公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将冻存的结直肠SW620细胞株接种于含质量分数为10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基中,置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养过夜,当细胞生长融合至80%左右,加入胰蛋白酶进行消化,传代培养。

1.3.2 CCK-8检测细胞活性

当细胞在细胞培养箱中生长汇合率达到80%时将细胞传代接种至24孔板中(每孔100 μL),使用不同浓度的罗哌卡因处理(1、5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL)放入温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后,分别培养0、1、2、3 d后加10 μL CCK-8溶液培养2 h后使用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光度值,计算结直肠SW620细胞的增长率。抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞膜电位及细胞周期和凋亡情况

取与相应药物孵育至对数生长期的结直肠SW620细胞接种于24孔板内,采用PBS调整细胞浓度至每毫升6×105个,培养48 h后收集细胞,一部分放入流式细胞样管中,使用离心机在2000 r/min的条件下离心5 min,弃上清,加入浓度为5 μg/mL的Rhodamine 200 μL避光孵育30 min,使用流式细胞仪分析结直肠SW620细胞的膜电位情况。另一部分加入200 μL质量分数为50 ng/L的PI和质量分数为20 ng/L的Nase A染液,在温度为4℃避光条件下,共同孵育30 min,上用流式细胞仪分析结直肠SW620细胞周期及凋亡率情况。

1.3.4 Western blot检测结直肠SW620细胞蛋白表达水平

取与相应药物孵育至对数生长期的结直肠SW620细胞,离心(4℃,10 min),采用裂解液裂解后提取总蛋白。依次进行电泳、转PVDF膜,加入质量分数为5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9抗体(稀释比例均为1∶500),温度为4℃条件下孵育过夜,加入二抗,常规孵育2 h,计算各蛋白相对内参蛋白为GADPH的表达水平。

1.4 统计学方法

采用软件为GraphPad Prism5软件作图,采用软件为SPSS 22.0软件分析所有试验数据,多组间比较使用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CCK-8检测癌细胞活力结果

使用CCK-8实验检测使用不同浓度罗哌卡因处理后发现,当使用罗哌卡因浓度为10 μg/mL时,对结肠癌细胞的抑制率约为(92.01±4.00)%显著低于使用哌卡因浓度为1 μg/mL时的抑制率(99.00±0.01)%;随着使用罗哌卡因浓度增加,结肠癌细胞的抑制率逐渐降低(P<0.05),依据本实验检测结果显示,结直肠癌SW620细胞的半数致死浓度约为69.36 μg/mL,见图1。

图1 CCK-8检测癌细胞活力结果(n=24)Figure 1 Viability of cancer cells detected by CCK-8

2.2 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞线粒体膜电位影响

检测各组细胞线粒体膜电位发现,相比结直肠癌SW620细胞,低剂量罗哌卡因组细胞膜电位显著降低(P<0.01);相比低剂量罗哌卡因组,中剂量罗哌卡因组细胞膜电位显著降低(P<0.01);相比中剂量罗哌卡因组,高剂量罗哌卡因组细胞膜电位显著降低(P<0.01),见图2。

2.3 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞周期及凋亡影响

检测罗哌卡因对各组人结直肠癌SW620细胞周期及凋亡影响发现,相比结直肠癌细胞组,低剂量罗哌卡因组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率均显著升高,G2/M期和S期细胞比例均显著降低(P<0.01);相比低剂量罗哌卡因组,中剂量罗哌卡因组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率均显著升高,G2/M期和S期细胞比例均显著降低(P<0.01);相比中剂量罗哌卡因组,高剂量罗哌卡因组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率均显著升高,G2/M期和S期细胞比例均显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞周期及凋亡影响(¯x±s,n=24)Table 1 Effects of ropivacaine on the cycle and apoptosis of human CRC cells

2.4 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞凋亡蛋白表达影响

蛋白质印迹法检测各组细胞凋亡蛋白发现,相比结直肠癌细胞组,低剂量罗哌卡因组Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高,Bax蛋白表达显著降低(P<0.01);相比低剂量罗哌卡因组,中剂量罗哌卡因组Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高,Bax蛋白表达显著降低(P<0.01);相比中剂量罗哌卡因组,高剂量罗哌卡因组Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高,Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),见图3和表2。

表2 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞凋亡蛋白相对表达量影响(¯x±s,n=24)Table 2 Effects of ropivacaine on the relative expression levels of apoptosis proteins in human CRC cells

注:与结直肠癌细胞组相比,∗∗P<0.01;与低剂量罗哌卡因组相比,##P<0.01;与中剂量罗哌卡因组相比,&&P<0.01。图2 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞线粒体膜电位影响(n=24)Note.Compared with colorectal cancer cell group,∗∗P<0.01.Compared with low-dose ropivacaine group,##P<0.01.Compared with medium-dose ropivacaine group,&&P<0.01.Figure 2 Effects of ropivacaine on MMP in human CRC cells

注:A:结直肠癌细胞组;B:低剂量罗哌卡因组;C:中剂量罗哌卡因组;D:高剂量罗哌卡因组。图3 罗哌卡因对人结直肠癌SW620细胞凋亡蛋白表达影响(n=24)Note.A,CRC cell group.B,Low-dose ropivacaine group.C,Medium-dose ropivacaine group.D,High-dose ropivacaine group.Figure 3 Effects of ropivacaine on the expression of apoptosis proteins in human CRC cells

3 讨论

细胞凋亡是指由基因调控的细胞自主性的程序性死亡,细胞主要通过细胞的凋亡调控内环境[8]。目前研究表明,细胞凋亡主要有3种途径:Bcl-2/Bax介导的线粒体细胞凋亡通路、死亡受体途径介导的细胞凋亡通路和内质网通路[9]。其中线粒体通路是目前研究的凋亡通路中最经典的凋亡通路。Baechler等[10]研究表明:线粒体通路途径可通过改变线粒体膜通透性,引起细胞膜内外Ca2+平衡被打破,使得细胞膜内外出现电位差,当线粒体膜电位降低会导致线粒体呼吸(电子传递)加速,氧自由基生成增加,发生氧化应激反应使得细胞凋亡。因此本研究检测了各组膜内外电位变化,发现相比结直肠癌细胞组,使用罗哌卡因各组细胞膜电位显著降低。说明使用罗哌卡因可以改变线粒体膜通透性,导致膜内外Ca2+平衡被打破,降低细胞膜内电位,促进氧化应激反应诱导细胞凋亡。

线粒体通路途径诱导细胞凋亡除了通过改变粒体膜通透性引起膜电位差外,还可以通过活化Caspase等蛋白酶家族,诱导凋亡相关因子的释放等,引起细胞凋亡的级联反应,最终导致细胞凋亡[11]。目前研究较多的细胞凋亡相关蛋白家族主要包括Caspase家族和Bcl-2家族。Caspase家族中Caspase-3是常见的启动子,Caspase-9是常见的执行子[12]。当细胞接收到凋亡信号后会激活Caspase-3,促进Caspase-9自身裂解产生pro-Caspase-9,并反过来再次活化Caspase-3引发细胞凋亡的级联反应[13]。除了Caspase家族,在Bcl-2家族中主要包括促凋亡基因Bcl-2和抑凋亡基因Bax[14]。本研究通过蛋白质印迹实验发现,相比结直肠癌细胞组,使用罗哌卡因处理各组结直肠癌SW620细胞中Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白相对表达水平升高,Bax蛋白表达下降。说明罗哌卡因处理可以激活Caspase家族中的凋启动子并促进Bcl-2家族中的促凋亡基因的表达。王文婷等[15]研究表明:罗哌卡因作用结直肠癌SW620细胞后可以调节凋亡相关蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡,本研究得出的结论与其相一致。

细胞周期可分为4个时相:G1、S、G2、M。其中G1期是DNA合前期,主要合成RNA和核糖体;G2期是DNA合成后期,主要是RNA和蛋白质的合成;M期是细胞裂期,所有细胞执行定物功能;S期是分裂期[16]。在细胞周期中每一个误差都可能导致遗传信息的改变[17]。本研究通过检测细胞周期发现,相比结直肠癌细胞,使用罗哌卡因各组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率均显著升高,G2/M期和S期细胞比例均显著降低。姬宁宁等[18]研究表明:罗哌卡因可以通过阻滞细胞周期,抑制癌细胞的增殖。研究结果说明使用罗哌卡因可以有效将SW620细胞阻滞与G0/G1期,这可能是因为用罗哌卡因将阻滞了结直肠癌SW620细胞合成RNA和核糖体并使得细胞分裂所需的必要蛋白合成受阻导致癌细胞的增殖受到抑制。

综上所述,罗哌卡因可以通过线粒体途径促进人结直肠SW620细胞的凋亡,其作用机制可能与Caspase-3及Bcl-2信号传导相关。