转FBP7::iaaM 基因陆地棉育种应用初报

程成，李斌，王雅丽，赵楠，苏莹，聂虎帅，华金平

（中国农业大学农学院棉花遗传育种与基因组研究实验室／作物遗传改良北京市重点实验室／杂种优势利用教育部重点实验室，北京 100193）

陆地棉（Gossypium hirsutumL.）是重要的经济作物[1]。棉花新品种选育过程中，产量潜力与纤维品质呈负相关，同步改良难度大[1-2]。 棉花纤维是一种高度伸长的细胞，由胚珠表皮细胞发育而来[3]。 棉纤维的发育包括4 个不同但又相互重叠的时期：起始期、伸长期、次生壁细胞积累期和成熟期。 纤维的起始和伸长对纤维的数量、长度和细度有很大的影响，是决定皮棉产量和品质的主要阶段[4]。

植物激素在棉花纤维发育过程中起重要作用。 生长素具有多方面生理效应，是胚珠体外培养所必需的植物激素[5]。 外源施用吲哚-3- 乙酸（Indole-3-acetic acid,IAA）可以促进纤维的起始[6]，增加胚珠表皮纤维数量[7]。研究发现，来源于根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）以及假单孢菌（Pseudomonas savastanai）的iaaM基因[8]，编 码色氨酸单加氧酶 （Tryptophan mono-oxygenase），参与由色氨酸产生IAA 的生物合成途径[9]。iaaM基因在E6 启动子的驱动下在陆地棉DP50 中高效表达，可显著增加内源IAA 含量，但对纤维品质无明显影响[10]。 将由矮牵牛种子表皮特异启动子FBP7 启动的植物生长素受体iaaM基因转入棉花品种冀棉14 中育成的转基因棉新种质IF1-1， 棉花胚珠纤维起始期表皮细胞IAA 水平提高，种子短绒减少，皮棉产量和纤维细度显著提高[1]。

关于棉花种质IF1-1 育种应用已有一系列报道。 以IF1-1 为父本，将iaaM基因转育到9 个综合性状优良的棉花品种中，证明该基因能显著改良棉花F1和F2的衣分和马克隆值，并且对籽指、铃重、单株结铃数等产量性状和纤维长度、强度等品质性状无负效应[11]。 以IF1-1 为父本，通过回交育种将iaaM基因导入低衣分、 高马克隆值的短季棉晋棉11，回交后代衣分提高，马克隆值降低，早熟性好[12]。 以IF1-1 为父本配制6 个杂交组合， 发现iaaM基因可显著提高纤维上半部平均长度、长度整齐度指数和断裂比强度，降低籽指，且6 个组合的籽指与衣分、纤维上半部平均长度均呈负相关[13]。 以IF1-1 为供体将iaaM基因转育到86 个衣分和纤维细度有待改良的棉花品系（种）中，可显著改良马克隆值，且对其他性状无不利影响[14]。 以IF1-1 为父本与鄂赣棉29 等13份母本材料杂交，以赣棉杂1 号为对照，发现大多数杂交组合的铃重、籽指等表现为正向竞争优势，部分组合纤维品质有显著竞争优势[15]。 以IF1-1 与鄂抗棉10 号选、TM-1、冀棉14、优质-1等材料分别进行正反交， 分析F1主要农艺性状，发现：多数组合铃重增加，衣分提高，马克隆值改良[16]。通过杂交将父本IF1-1 中的iaaM基因转入母本N027、N028、N106、N030，结果发现iaaM基因与衣分弱正相关， 与纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度显著正相关，与马克隆值显著负相关，与断裂伸长率负相关[17]。 上述研究未对杂交后代进行分子检测， 影响结果的可靠性。

本研究以IF1-1 为父本， 与不同遗传背景的棉花品种组配，结合分子检测确定杂交种，通过对杂种F1的衣分、 籽指和纤维品质性状分析，研究IF1-1 在棉花产量和纤维品质改良中的作用，分析FBP7::iaaM基因是否对种子发芽率和发芽势产生负面效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转FBP7::iaaM基因的陆地棉种质系IF1-1[1]，由西南大学裴炎教授、侯磊教授研究团队提供。

母本材料包括中棉所12 及其系谱涉及的材料共7 份[18]（包括中棉所12 及亲本乌干达4 号、邢台6871；亲本系谱涉及的早代亲本品种：鲁棉研16、豫棉11、晋棉33、晋棉20，均由中国农业科学院棉花研究所叶武威研究员团队提供）；鄂抗棉9 号及其骨干亲本共16 份材料[19]（包括中棉所2 号、陕棉7 号、陕棉3 号、鄂抗棉9 号、岱字棉15、徐州1818、鄂荆1 号、锦育3 号、中7263、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号、安通SP21、隆字棉、锦3-34-3、川57-681，由中国农业科学院棉花研究所杨代刚研究员、马雄风研究员团队提供）。

1.2 IF1-1 阳性材料鉴定

2018 年冬在海南三亚种植IF1-1 材料，分单株提取植株叶片DNA，提取方法是改良的CTAB法[20]。 通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测阳性植株，使用的引物见表1。使用2 对引物组合（IF_up/IF_dn1，IF_up/IF_dn2）扩增结果均为阳性，则认为植株携带iaaM基因。

表1 IF1-1 的阳性植株分子鉴定引物序列Table 1 The primers used in FBP7::iaaM gene detection

1.3 配组F1 材料及鉴定

以阳性IF1-1 为父本，2018 年冬在海南与23份不同遗传背景的棉花品种杂交。F1与亲本材料于2019 年夏季在河北省河间市国欣总会试验基地种植2 行区（行长5 m）。 取部分植株样品进行检测。F1阳性植株鉴定使用的引物和基因检测方法同1.2。

1.4 考种和纤维品质检测

F1阳性植株和23 份棉花品种各收20 个铃，用于考种。 考种指标为小样衣分和籽指。 轧花考种后，取15 g 纤维样品寄送中国彩棉（集团）股份有限公司测试中心（乌鲁木齐）使用USTERRHVI 棉纤维测试系统完成纤维品质检测。 纤维品质测定指标包括纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、断裂伸长率和马克隆值。

1.5 种子发芽试验

F1与母本棉籽脱绒， 用于种子发芽试验，试验采用滤纸卷直立法[21]。选取50 粒发育正常的种子用蒸馏水浸种8 h，种子露白后，珠孔朝下均匀地摆放在滤纸上，用滤纸卷好，垂直放入大烧杯中，加入适量蒸馏水使滤纸保持湿润，置于28 ℃恒温培养箱中暗培养。 3 d 后统计种子发芽势（Germination potential，GP），7 d 后统计种子发芽率（Germination rate，GR）。 试验设3 次重复。

1.6 数据统计与分析

使用IBM SPSS Statistics 21.0 完成性状数据的方差分析和相关性分析。 相关性的显著性分析采用双侧检验。

2 结果与分析

2.1 IF1-1 和F1 阳性植株的分子鉴定

IF1-1 材料分单株提取叶片DNA， 使用表1的引物进行PCR 检测。 结果在检测的23 个单株中，18 株为转基因阳性株 （图1）， 阳性株率为78.26%。

F1种子于2019 年在河北省河间市种植，每个材料取10 株 （单行不足10 株的取全部单株）挂牌、取样、提取DNA，共鉴定222 株。23 个组合F1经PCR 检测得到69 株阳性株， 阳性株率为31.08%。其中，邢台6871、陕棉7 号、鄂抗棉9 号、鄂荆1 号、 川57-681 的F1仅检测到1 株阳性株（表2）。

表2 IF1-1 配组杂交F1 材料植株阳性检测Table 2 Detection of positive individuals of F1 with FBP7::iaaM gene

2.2 F1 与母本衣分差异比较

IF1-1 携带的FBP7::iaaM基因转入不同品系后，大部分F1衣分显著提高。本研究检测了23 份F1材料的衣分， 其中21 个杂交组合F1较对照母本提高1.73～11.82 百分点（表3），平均提高6.60百分点。 其中，鲁棉研16 的F1衣分增幅最大。 例外的是， 晋棉20、 鄂抗棉9 号的衣分分别为44.91%、42.69%， 相应的F1衣分分别降低为43.87%、42.25%（仍为高衣分材料）。

表3 杂种F1 与母本的衣分比较Table 3 Difference analysis on lint percentage of F1 hybrids and female parents %

中棉所12 及其系谱材料：中棉所12 衣分为41.58%，中棉所12 的F1提高了2.81 百分点。 衣分高于中棉所12 的系谱材料， 其F1衣分增幅均低于中棉所12 的F1； 衣分低于中棉所12 的，其F1衣分增幅反而高于中棉所12 的F1。

鄂抗棉9 号及其骨干亲本：鄂抗棉9 号衣分为42.69%， 其F1衣分为42.25%（降低了0.44 百分点）；鄂荆1 号衣分为44.30%，其F1衣分提高7.37 百分点，为51.67%。 一些衣分低的材料其F1衣分显著提高。

2.3 杂种F1 与母本籽指、发芽势、发芽率的差异

相对于各母本，22 个F1的籽指降低0.2～5.3 g，平均降低1.8 g；岱字棉15/IF1-1 的F1籽指降幅最大；仅晋棉20/IF1-1 的F1籽指比母本提高0.9 g（表4）。

中棉所12 籽指11.6 g， 对应的F1籽指降低了0.8 g。 亲本乌干达4 号和邢台6871 的籽指分别为14.6 g、11.6 g， 相应的F1籽指分别为11.2 g、9.6 g，其F1籽指降幅均高于中棉所12 的F1。

鄂抗棉9 号籽指为10.7 g，相应F1的籽指为9.9 g，降低0.8 g；骨干亲本中7263、陕棉7 号、锦棉2 号、鄂荆1 号籽指分别为14.2 g、13.7 g、13.0 g、12.7 g， 相应的F1籽指分别为13.2 g、10.4 g、10.6 g、9.5 g， 较各自母本分别降低1.0 g、3.3 g、2.4 g、3.2 g（表4）。

20 份F1材料种子发芽试验结果表明， 有10份材料F1的发芽势高于或等于其母本发芽势。方差分析发现，F1的发芽率和发芽势与相应母本的发芽率和发芽势差异均不显著（表4）。

表4 F1 与母本籽指、发芽势与发芽率比较分析Table 4 Difference between F1 and female parent in seed index, seed germination potential and seed germination rate

2.4 材料的纤维品质表现

IF1-1 对纤维品质性状尤其是马克隆值的影响值得关注。 其中，鄂荆1 号的F1的纤维品质数据缺失。 其余22 份F1的纤维品质检测结果（表5）表明，马克隆值处于A 档的F1材料相应母本为邢台6871、中棉所12、鲁棉研16、豫棉11、晋棉20、鄂抗棉9 号、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号这9 份；处于C 档的材料母本为陕棉7 号、岱字棉15、安通SP21、锦3-34-3、川57-681；其余8 份材料均为B 档。 相应地，22 份母本材料马克隆值处于A 档的有：陕棉7 号、鄂抗棉9 号、锦育3 号、安通SP21、锦3-34-3、川57-681；处于C 档的材料有：豫棉11、陕棉3 号、岱字棉15、中7263、隆字棉；其余11 份材料均为B 档。 因此，11 份材料马克隆值等级得到提升。 中棉所12 及其系谱材料的F1马克隆值等级提升的有：邢台6871、中棉所12、鲁棉研16、豫棉11、晋棉20；鄂抗棉9 号及其骨干亲本的F1马克隆值等级提升的有：陕棉3 号、中7263、MO-3、锦棉2 号、荆棉4 号、隆字棉。 5 份材料F1的马克隆值等级下降，其余6 份材料F1的马克隆值等级不变（表5）。

22 份母本材料的纤维上半部平均长度范围为26.05～31.82 mm，平均为29.07 mm，其中陕棉7 号最长，锦棉2 号最短；相应的F1纤维上半部平均长度范围为27.40～32.25 mm， 平均为30.40 mm，其中鲁棉研16 的F1最长，安通SP21的F1最短。 与母本相比，有17 个F1纤维上半部平均长度增加，平均增加2.0 mm。中棉所12 纤维上半部平均长度为29.44 mm， 对应的F1增加2.50 mm，是中棉所12 系谱材料中增幅最高的。鄂抗棉9 号纤维上半部平均长度为29.16 mm，对应的F1增加了1.87 mm；纤维上半部平均长度大于鄂抗棉9 号的骨干亲本，其F1纤维上半部平均长度增幅均小于鄂抗棉9 号F1的增幅（表5）。

表5 F1 与母本材料纤维品质性状表现Table 5 The comparison on fiber quality traits between F1 and its female parents

22 份母本材料的长度整齐度指数为82.10%～87.65%，平均为84.57%，其中中棉所12 长度整齐度指数最高，锦育3 号的最低。22 个F1的长度整齐度指数为80.80%～88.75%，平均为85.21%，中7263 的F1最高， 陕棉3 号的F1最低；13 份材料F1的长度整齐度指数较母本提高， 平均提高1.93 百分点（表5）。

22 份母本材料的断裂比强度为24.52～35.38 cN·tex－1，平均为28.74 cN·tex－1，其中陕棉7 号最高，陕棉3 号最低。 22 个F1的断裂比强度为27.13～33.21 cN·tex－1， 平均为30.24 cN·tex－1，其中中7263 相应的F1最高， 豫棉11 相应的F1最低。 14 份材料的断裂比强度提高（平均提高3.79 cN·tex－1）。 中 棉 所12 的 断 裂 比 强 度 为28.01 cN·tex－1， 对应的F1增加至31.46 cN·tex－1；鄂抗棉9 号纤维断裂比强度为27.34 cN·tex－1，对应的F1增加了5.34 cN·tex－1；断裂比强度高于鄂抗棉9 号的骨干亲本的F1断裂比强度增幅均小于鄂抗棉9 号的F1（表5）。

22 份母本材料的纤维断裂伸长率为4.91%～8.21%，平均为5.98%，其中荆棉4 号的断裂伸长率为8.21%，隆字棉的为4.91%。 22 个F1的断裂′伸长率为5.61%～8.22%，平均为6.79%，其中晋棉33 的F1断裂伸长率为8.22%， 锦棉2 号的F1断裂伸长率为5.61%；18 个F1的断裂伸长率增加，平均增加1.14 百分点（表5）。

对F1和母本的纤维品质进行方差分析发现：与相应母本比较，F1的纤维上半部平均长度和断裂伸长率差异极显著， 断裂比强度差异显著，长度整齐度指数和马克隆值差异不显著。

2.5 F1 和母本的衣分与籽指相关性分析

相关性分析发现，F1的衣分和母本的衣分的相关系数为0.569，达到极显著水平；F1的籽指和母本的籽指的相关系数为0.481， 显著正相关。

3 讨论与结论

本研究通过PCR 分子检测证明，FBP7::iaaM基因可在IF1-1 自交后代及杂种F1中稳定遗传，能够提高衣分。FBP7::iaaM基因转入冀棉14 后，受体衣分从40.6%提高至48.0%以上、 马克隆值从5.2 降低至4.5[1]。 肖钦之[16]研究发现FBP7::iaaM基因可以提高低衣分品种的衣分。 本研究以FBP7::iaaM转基因材料IF1-1 为供体亲本， 与不同遗传背景的棉花品种进行杂交， 其中21 个杂交组合的衣分不同程度地提高， 但是FBP7::iaaM基因在不同遗传背景的棉花材料中的表现存在差异，这与已有报道结果[1,11-13]吻合。 中棉所12 的系谱材料中，衣分比中棉所12 高的材料，其F1增幅均低于中棉所12 的F1。 鄂抗棉9 号及其骨干亲本的大多数材料也有类似趋势。 晋棉20和鄂抗棉9 号衣分分别为44.91%和42.69%，转入FBP7::iaaM基因后，其F1衣分反而略有降低；鄂荆1 号衣分为44.30%，其F1衣分明显提高，说明利用FBP7::iaaM基因提高衣分还是需要对受体材料进行选择。 此外，母本材料和相应的F1纤维品质分析结果表明，部分材料F1的纤维品质指标不同程度地提高。 这说明结合有效的育种选择， 利用FBP7::iaaM基因提高衣分同步改良品质是可能的[11,16]。

衣分和籽指可能存在负相关，FBP7::iaaM基因会使棉花种子质量变小，籽指下降。季灵艳[22]研究发现，转iaaM基因材料IF1-1 的种仁棉酚含量显著低于对照材料。 陈旭升等[23]研究表明，转iaaM种质的籽指偏小，种子空瘪率上升。 本研究发现，23 份F1材料中仅晋棉20 的F1籽指较母本有所提高， 原因是晋棉20 籽指较低仅为9.73 g。相关性分析发现，F1籽指与母本籽指呈显著正相关；因此，在利用FBP7::iaaM基因时应选择籽指较高的材料作为母本。

发芽试验结果显示，F1的发芽率和发芽势与母本的无显著差异，说明一定范围内籽指降低不影响种子发芽率和发芽势。FBP7::iaaM基因的转入是否会影响棉铃种子数和不孕籽率有待于后续试验验证。

综上所述，转FBP7::iaaM基因的IF1-1 种质系可提高部分杂种后代的纤维品质和产量性状，在同步改良棉花纤维品质和产量方面有重要的利用价值。