超高效液相色谱法同时测定颈舒颗粒中4种皂苷类成分含量

李天佑，何 羽

（贵州省毕节市市场监督管理局检验检测中心，贵州 毕节551700）

颈舒颗粒由三七、川芎、当归、红花、肉桂、天麻、人工牛黄7味中药组方[1]，具有活血化瘀、温经通窍止痛功效，治疗颈椎病效果较好[2－4]。方中三七为君药，功能散瘀止血、消肿定痛，用于治疗出血、瘀滞肿痛、跌打损伤、胸腹刺痛等症。2015年版《中国药典（一部）》收载的颈舒颗粒[1]，含量测定项下仅对三七中人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1成分进行指标控制。超高效液相色谱（UPLC）法灵敏度高，分离效果好，检测快速，可快捷、全面控制颈舒颗粒中三七的质量。本研究中采用UPLC法同时测定颈舒颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量[5－9]，可为该制剂的检测、开发及质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY Classs型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；PS－G60A型超声波清洗机（东莞市洁康超声波设备有限公司，功率为360 W，频率为40 kHz）；ATSmol 1850C型超纯水机(天津市泰斯特仪器有限公司)；MSE3.6P－OCE－DM型电子天平(赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司，精度为百万分之一)；AY120型电子天平(日本岛津公司，精度为万分之一)。

1.2 试药

颈舒颗粒(国药集团精方＜安徽＞药业股份有限公司，批号分别为200212，200403，191206)；三七皂苷R1对照品（批号为110745－201921，纯度为93.1%），人参皂苷Rb1对照品（批号为110704－201827，纯度为93.1%），人 参 皂 苷Rg1对 照 品（批 号 为110703－201933，纯度为93.4%），人参皂苷Re对照品（批号为110754－201827，纯度为93.4%），均购于中国食品药品检定研究院；肉桂(批号为170501)，当归(批号为190403)，红花(批号为190701)，天麻(批号为180601)，川芎(批号为190401)，均购于贵州达灵药业有限公司；人工牛黄（四川菲德力制药有限公司，批号为170101）；乙醚、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，均购于美国Tedia试剂公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WatersBEHC18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.6 mL／min；检测波长：203 nm；柱温：30℃；进样量：1 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制备

分别取三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Re对照品2.281，2.737，4.103，1.220 mg，精密称定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取样品（批号为200212）1.0 g，混匀，研细，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，水浴微沸回流提取1 h，滤过，滤纸及药渣挥干后置同一具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，取甲醇20 mL，分2次洗涤滤渣，滤液置同一蒸发皿中，蒸干，加水20 mL使残渣溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得供试品溶液。取肉桂、当归、红花、天麻、川芎、人工牛黄，按颈舒颗粒处方及制备工艺煎煮、浓缩制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂(甲醇)及阴性对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件分别进样分析，色谱图见图1。结果供试品溶液4个主成分色谱峰与混合对照品溶液的4个主成分色谱峰保留时间一致，且在10 min内完全分离，分离度均大于1.5，阴性对照无干扰。

图1 超高效液相色谱图1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Blank solvent（methanol）B.Mixed reference solution C.Negative reference solution D.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.2项下混合对照品溶液0.1，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、各化学成分含量（X，μg）为横坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 4种化学成分线性关系考察结果(n＝7)Tab.2 Results of linear relation test of four chemical constituents（n＝7）

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定6次。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re峰面积的RSD分别为0.29%，0.63%，0.12%，0.83%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取2.2项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，4，6，8，12，16，24 h时进样测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参 皂 苷Re峰 面 积 的RSD分 别 为1.08%，1.44%，0.96%，1.87%（n＝7），表明供试品溶液中4种皂苷成分在室温下24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为200212）适量，精密称定，共5份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人 参 皂 苷Re峰 面 积 的RSD分 别 为0.34%，0.41%，0.19%，0.84%（n＝5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为200212）1.0 g，精密称定，共6份，加入混合对照品溶液（三七皂苷R10.406 mg／mL、人参皂苷Rg10.907 mg／mL、人参皂苷Re 0.229 mg／mL、人参皂苷Rb10.466 mg／mL）3 mL，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表3。

表3 颈舒颗粒中4种皂苷成分的加样回收试验结果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test of four saponins in Jingshu Granules（n＝6）

2.4 高效液相色谱(HPLC)法比较

取2.2项下混合对照品溶液和供试品溶液，按颈舒颗粒含量测定三七项下的色谱条件[1]进样分析。色谱柱采用CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）。结果供试品溶液中4个主成分色谱峰与混合对照品溶液中4个主成分色谱峰保留时间一致，且在70 min内完全分离，分离度均大于1.5。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图（203 nm）1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solution Fig.2 HPLC chromatograms(203 nm)

2.5 样品中皂苷类成分含量测定

取 样 品3批(批 号 分 别 为200212，191206，200403)，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下和2.4项下色谱条件测定样品中4种皂苷类成分的含量，再与2015年版《中国药典（一部）》颈舒颗粒三七含量测定项下的色谱条件和供试品溶液前处理方法测定结果进行比较。结果见表4。

表4 3种方法测定颈舒颗粒中4种皂苷类成分的含量（mg）Tab.4 Content determination of four saponins in each bag of Jingshu Granules determined by three methods（mg）

3 讨论

原标准中乙醚脱脂静置12 h时间过长。参考文献[10－16]，曾对比乙醚静置、超声和加热回流脱脂后甲醇提取方法，综合考虑采用甲醇超声处理。结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的提取效率均高于2015年版《中国药典（一部）》颈舒颗粒三七含量测定项下的样品前处理方法。

用甲醇超声提取后直接进样分析，在三七皂苷R1峰处和人参皂苷Rb1峰处杂质峰太多，影响分离度。将甲醇提取液蒸干，加水溶解，再用水饱和正丁醇提取，蒸干，甲醇溶解后进样分析。结果在三七皂苷R1峰处和人参皂苷Rb1峰处杂质峰均减少，达到完全分离（R＞1.5）。

HPLC法和UPLC法同时测定颈舒颗粒的含量，结果各成分测定值的RSD均小于1.5%，故可用UPLC法代替HPLC法测定颈舒颗粒中4种皂苷类成分的含量。

参考文献[1]中的方法，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1完全分离至少需要70 min，采用UPLC法在10 min内就可同时完全分离人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re4种成分，比原标准增加2个皂苷类成分的质量控制，同时极大地缩短了分析时间，减少了试药的用量。