润州凤头白鸭不同组织矿物元素沉积及相关基因表达研究

白皓, 李潇凡, 仲黎, 宋倩倩, 刘本帅, 张莘,张扬, 王志秀, 江勇, 徐琪, 常国斌,, 陈国宏,*

(1.扬州大学农业科技发展研究院，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009; 2.扬州大学动物科学与技术学院, 江苏 扬州 225009)

矿物元素对人体生长发育至关重要，是新陈代谢过程中不可或缺的营养元素。如镁元素几乎参与机体所有的新陈代谢过程[1]，钾元素可以促使神经传导功能正常运行[2]，铁元素与缺铁性贫血和氧化还原等代谢紊乱密切相关[3]，锌元素能抵抗和消灭体内的病原微生物[4]，硒元素可以增强机体免疫功能[5]。虽然这些矿物元素对维持人体正常生命活动和内环境稳态非常重要，然而人体自身不能合成，需要从各类食物中获取。鸭肉是人们生活中重要的食品，除了含有优质的蛋白质和维生素，还富含有多种矿物元素。2019年，我国商品肉鸭出栏43.8亿只，约占全球总量的68%，总产值超过1 357亿元[6]。因此，大量的肉鸭产品是人体矿物元素的主要来源之一。近年来，随着人们消费水平的提高以及对禽肉产品质量的追求，禽类的饲养量不断增加。小体型优质肉鸭具有体型小、风味独特、营养价值高的特点，深受消费者欢迎[7]。润州凤头白鸭作为我国古老的小体型优质肉鸭遗传资源，其肉质细腻、味道鲜美，富含人体必需的多种矿物元素。

大量研究表明，矿物元素的沉积和分解受到一些元素相关基因的影响。瞬时受体电位离子通道(transient receptor potential melastatin, TRPM)家族成员通道6(TRPM6)和通道7(TRPM7)基因是调控细胞Mg2+平衡的关键[8]。钠钾泵(Na+/K+-ATP酶)是细胞膜上一种重要的离子转运系统，在调节血管张力和血压方面起着重要作用，其中Na+/K+-ATP酶α1亚基(ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 1, ATP1A1)和Na+/K+-ATP酶β1亚基(ATPase Na+/K+transporting subunit beta 1, ATP1B1)影响Na+/K+-ATP酶的活性[9]；铁蛋白基因包括轻链和重链两个亚基，重链蛋白由FTH1(铁蛋白重链多肽1，ferritin heavy chain 1)基因编码，其具有较强的亚铁氧化酶活性，可以储存和释放铁元素[10]；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是动物机体中含量最为丰富的硒蛋白，该家族中的谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1, GPX1)是首个被鉴定的硒蛋白，是体内重要的抗氧化防御系统，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 1, GPX4)主要对磷脂过氧化氢物进行催化还原，对生物膜具有抗氧化保护作用[11]；氧化磷酸化过程的关键酶是位于线粒体内膜上的ATP合成酶[12]，Zn+对ATP合成酶的增强效应与Zn+的浓度相关，因此Zn+被认为是ATP受体的调制物[13]，ATP6(ATP合成酶亚单位6，ATP synthase F0 subunit 6)和ATP8(亚单位8，ATP synthase F0 subunit 8)都是重要的线粒体基因。

肉鸭不仅是各种矿物元素的载体和供体，矿物元素的沉积与代谢也与肉鸭的生长性能、肉品质和抗病力密切相关。因此，研究矿物元素沉积对促进肉鸭生产和提高鸭肉品质具有重要意义。本研究以润州凤头白鸭为研究对象，探究了不同组织中主要矿物元素随日龄增加的沉积规律以及相关基因的表达水平，旨在明确小体型优质肉鸭选育指标及最佳出栏日龄，筛选矿物元素含量检测关键标志基因，为建立小体型优质肉鸭高效育种技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验选用150只0日龄的润州凤头白鸭(小体型白羽肉鸭，公母各半)为研究对象，设置5个试验重复，每个重复30只，公母混养。采用上网下床模式饲养至63日龄。所有试验鸭饲养管理和环境控制条件相同，试验期间自由采食和饮水。不同饲养阶段供给的日粮配方及饲料营养水平见表1，其中，每公斤复合预混料成分为：膨润土44.46 g、赖氨酸3.24 g、DL-MHA-FA(88%)0.99 g、苏氨酸0.73 g、氯化钠4.40 g、碳酸氢钠2.00 g、硫酸钠2.00 g、维康宝0.20 g、氯化胆碱(60%)1.00 g、金多微0.53 g、金羽康0.15 g、C-811酶0.30 g。在试验开始前，对鸭舍进行通风和严格的消毒，定期按照常规的免疫程序对试验鸭进行免疫接种，至63日龄结束。

表1 日粮配方及饲料营养水平Table 1 Composition and nutrient of the experimental diets

1.2 样品采集

在0、21、35、49和63日龄时，每个重复随机挑选公母鸭各1只(共10只)，采集胸肌、腿肌、肝脏、背皮(背部脊骨正中间)和胫骨5种组织样品，每种组织采集5 g样品于-20 ℃保存，用于矿物元素含量测定。采集肝脏组织样品0.5 g，放入装有RNA保护液的离心管中，于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.3 矿物元素测定指标与方法

1.3.1组织前处理 将试验鸭的胸肌、腿肌、肝脏和背皮样品分别加入浓硝酸和过氧化氢中，在消解仪[Multiwave 3000,安东帕(中国)有限公司]中高压消解，放入加热炉中除去硝酸，加入超纯水定容，完全溶解后进行检测。统一采集试验鸭的右侧胫骨，用去离子水冲洗后再用滤纸吸干，放入70～80 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干，随后用研钵研碎，放入干燥器中保存备用。矿物元素检测前处理的实验步骤参照国标GB/T9695(铁、镁、锌)[14-16]和已有研究(钾、硒)[17-18]，使用微波消解仪进行消解。

1.3.2矿物元素含量测定 利用AFS-2202a原子荧光光度计(北京吉天仪器公司)测定样品中镁、钾、铁、锌和硒的含量。仪器设定条件如下：雾化器流量0.80 L·min-1，辅助气流量0.20 L·min-1，等离子气流量15 L·min-1，射频发生器功率1.3 kW，样品提升量1.5 mL·min-1。

1.4 引物设计

根据NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)绿头野鸭TRPM6、TRPM7、ATP1A1、ATP1B1、FTH1、GPX1、GPX4、ATP6和ATP8基因的mRNA序列设计引物(表2)[19]，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.5 总RNA提取

采用天根公司的TRizol试剂盒提取肝脏组织总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，使用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测总RNA的浓度和纯度(OD260/OD280=1.8～2.1)，最后用TE将样品稀释至相同浓度。

1.6 cDNA合成

利用天根公司的反转录试剂盒合成cDNA。反应体系20 μL：总RNA 2 μL (500 ng·μL-1)，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNase-Free ddH2O 14 μL补至20 μL。混匀后于42 ℃反应15 min，95 ℃反应3 min，反转录产物于-20 ℃保存备用。

1.7 qRT-PCR

根据ABI实时荧光定量PCR的步骤和要求配置反应体系：cDNA模板2 μL，PoweUpTMSYBRTMGreen master Mix(2×)5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 2.2 μL补至10 μL。荧光定量程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 15 s。扩增结束后进行熔解曲线分析，每个样品设置3个重复，取平均值。

1.8 统计分析

使用Excel 2016软件对表型和qRT-PCR结果进行数据整理，基因相对表达量采用2-ΔΔCT方法计算[20]。采用SAS 9.4软件分别对矿物元素含量和基因表达量数据进行单因素方差分析，并采用Duncan法进行多重比较分析；采用Bivariate Correlation分析各矿物元素之间以及目的基因相对表达量与矿物元素含量之间的相关性，结果以(平均值±标准差)表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同组织中矿物元素沉积规律分析

不同日龄润州凤头白鸭组织中矿物元素的沉积规律如图1所示。

2.1.1胸肌中矿物元素沉积规律分析 在胸肌组织中，镁和钾元素的沉积规律一致，表现为随日龄增加呈显著(P<0.05)升高的趋势，两种元素在49—63日龄时的含量达到峰值并趋于稳定；锌元素的沉积规律表现为随日龄增加呈显著性(P<0.05)下降的趋势；铁和硒元素的沉积规律均表现为先下降再升高再下降的趋势，两种元素在21日龄时的含量均显著低于其他日龄(P<0.05)，铁元素含量在49日龄时达到峰值(P<0.05)，而硒元素含量在0日龄时最高(P<0.05)。

A：胸肌；B：腿肌；C：肝脏；D：背皮；E：胫骨。图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。A: Breast muscle; B: Thigh muscle; C: Liver; D: Skin; E: Tibia. Different letters indicate significant differences (P<0.05).图1 不同组织中矿物元素的沉积规律Fig.1 Depositions of mineral elements in tissues at different ages

2.1.2腿肌中矿物元素沉积规律分析 在腿肌组织中，镁和钾元素的沉积规律与在胸肌组织中的沉积规律基本一致，随日龄增加显著(P<0.05)升高，并在49—63日龄时稳定沉积的趋势；锌元素的沉积规律与在胸肌组织中的沉积规律完全相反，随日龄增加逐渐升高，在49—63日龄时的含量趋于稳定，显著高于其他日龄(P<0.05)；铁元素的沉积规律表现为0—21日龄呈显著(P<0.05)下降再逐渐升高的趋势；硒元素的沉积规律与在胸肌组织中的沉积规律基本一致，在35日龄时的含量最高(P<0.05)。

2.1.3肝脏中矿物元素沉积规律分析 在肝脏组织中，5种矿物元素的沉积规律均表现为随日龄增加呈显著(P<0.05)升高的趋势。其中，铁元素在润州凤头白鸭21—49日龄生长阶段的肝脏中快速沉积，达到峰值。

2.1.4背皮中矿物元素沉积规律分析 在背皮组织中，5种矿物元素的沉积规律与上述3个组织有所不同。镁和钾元素的沉积规律仍然基本一致，表现为随日龄增加先升高再下降的趋势，两种元素在21日龄时的含量达到峰值；锌元素的沉积规律表现为先缓慢升高再呈显著(P<0.05)下降的趋势，在49日龄时的含量最低(P<0.05)；铁元素的沉积规律表现为0—21日龄显著(P<0.05)升高、21—35日龄显著(P<0.05)下降、35—49日龄再显著(P<0.05)升高、49—63日龄再显著(P<0.05)下降的趋势，在49日龄时的含量达到峰值(P<0.05)；硒元素的沉积规律与在胸肌和腿肌组织中的沉积规律基本一致，在35日龄时的含量最高(P<0.05)。

2.1.5胫骨中矿物元素沉积规律分析 在胫骨组织中，镁和钾元素的沉积规律与在背皮组织中的沉积规律基本一致，表现为随日龄增加先升高再下降的趋势，两种元素在21日龄时的含量达到峰值(P<0.05)；锌元素的沉积规律表现为在所有日龄稳定沉积，无显著性差异(P>0.05)；铁元素的沉积规律表现为随日龄增加呈先升高再下降的趋势，在21—35日龄时的含量最高(P<0.05)；硒元素的沉积规律表现为0—49日龄显著(P<0.05)下降、49—63日龄稳定沉积的趋势。

2.2 不同组织中矿物元素之间相关性分析

不同组织中不同矿物元素相关性分析如表3所示。

表3 不同组织中矿物元素沉积相关性Table 3 Correlation between depositions of mineral element in different organ

2.2.1胸肌中不同矿物元素之间相关性分析

胸肌组织中，镁元素与钾元素在润州凤头白鸭的5个生长阶段均高度正相关，其中0—21日龄呈极显著正相关(P<0.01)，49—63日龄呈显著正相关(P<0.05)。在0日龄时，镁元素与锌元素呈显著正相关(P<0.05)；在63日龄时，镁元素与硒元素呈显著正相关(P<0.05)。

2.2.2腿肌中不同矿物元素之间相关性分析

腿肌组织中，镁元素与钾元素在5个生长阶段均呈高度正相关，其中21日龄呈极显著正相关(P<0.01)，35—63日龄呈显著正相关(P<0.05)。在21日龄时，镁和钾元素分别与硒元素呈显著正相关(P<0.05)；在35日龄时，钾元素与锌元素呈显著正相关(P<0.05)；在49日龄时，镁元素与硒元素呈显著负相关(P<0.05)。

2.2.3肝脏中不同矿物元素之间相关性分析

肝脏组织中，镁元素与钾元素在5个生长阶段均呈高度正相关，其中63日龄呈极显著正相关(P<0.01)，21—49日龄呈显著正相关(P<0.05)。在0日龄时，硒元素与锌元素呈显著正相关(P<0.05)；在21日龄时，镁元素与硒元素呈显著正相关(P<0.05)，钾元素与铁元素呈极显著负相关(P<0.01)；在49日龄时，钾元素与锌元素呈显著正相关(P<0.05)；在63日龄时，钾元素与铁元素呈显著正相关(P<0.05)。

2.2.4背皮中不同矿物元素之间相关性分析

背皮组织中，镁元素与钾元素在5个生长阶段均呈高度正相关，其中21、35和63日龄呈极显著正相关(P<0.01)，0和49日龄呈显著正相关(P<0.05)。在0日龄时，硒元素与锌元素呈显著负相关(P<0.05)；在21日龄时，镁和锌元素分别与硒元素呈显著正相关(P<0.05)；在49日龄时，镁元素与硒元素和锌元素均呈显著正相关(P<0.05)；在63日龄时，钾元素与硒元素呈极显著正相关(P<0.01)，锌元素与镁元素、钾元素和铁元素均呈显著正相关(P<0.05)。

2.2.5胫骨中不同矿物元素之间相关性分析

胫骨组织中，镁元素与钾元素在5个生长阶段均呈高度正相关，其中0、21、35和63日龄呈显著正相关(P<0.05)。在35日龄时，镁元素与锌元素呈极显著正相关(P<0.01)；在63日龄时，铁元素与硒元素呈极显著负相关(P<0.01)。

2.3 基因表达水平及其与矿物元素之间相关性分析

2.3.1基因表达规律分析 肝脏组织中矿物元素相关基因的表达规律见图2。所有基因均以0日龄的表达水平作为对照组，比较不同日龄之间的基因表达差异。

镁元素相关基因TRPM6在21日龄时的表达水平最高(P<0.05)；TRPM7基因的表达规律表现为随日龄增加呈显著(P<0.05)升高再显著(P<0.05)下降的趋势，0日龄时的表达水平最低(P<0.05)，49日龄时达到峰值(P<0.05)。两个基因在21—35日龄时的表达规律相反，其他日龄基本一致。

钾元素相关基因ATP1A1在21日龄时的表达水平最低(P<0.05)，49日龄时的表达水平最高(P<0.05)；ATP1B1基因的表达规律表现为先升高再下降再升高再下降的趋势，0日龄时的表达水平最低(P<0.05)，49日龄时的表达水平最高(P<0.05)。两个基因在0—35日龄时的表达规律相反，35—63日龄基本一致。

铁元素相关基因FTH1的表达规律表现为随日龄增加呈显著性(P<0.05)升高的趋势，49—63日龄时的表达水平最高，显著高于0—35日龄(P<0.05)。

锌元素相关基因ATP6在0日龄时的表达水平最低(P<0.05)，49日龄时的表达水平最高(P<0.05)；ATP8基因的表达规律表现为先显著(P<0.05)升高再显著(P<0.05)下降的趋势，0日龄时的表达水平最低(P<0.05)，35日龄时的表达水平最高(P<0.05)。两个基因在21—49日龄时的表达规律相反，其他日龄基本一致。

硒元素相关基因GPX1的表达规律表现为0—35日龄显著性(P<0.05)下降，35—63日龄显著(P<0.05)升高的趋势，63日龄时的表达水平最高(P<0.05)；GPX4基因的表达规律表现为0—35日龄先升高再下降，35—63日龄显著(P<0.05)升高的趋势，63日龄时的表达水平最高(P<0.05)。

注： 图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05).图2 肝脏组织中矿物元素相关基因的表达规律Fig.2 Relative expression of genes in liver.

两个基因在0—35日龄时的表达规律相反，35—63日龄基本一致。

2.3.2基因表达与矿物元素之间相关性分析

由表4可知，仅有镁元素相关基因TRPM7的表达水平与镁元素在肝脏组织中的沉积呈显著性正相关(P<0.05)，其他基因表达水平与矿物元素沉积存在一定的正负相关性，但不显著(P>0.05)。

表4 基因表达量与矿物元素的相关性分析Table 4 Correlation analysis between expression levels of genes and depositions of mineral elements in liver

3 讨论

3.1 矿物元素沉积规律与相关性

矿物元素作为机体酶、激素和维生素等生物活性物质的重要组成成分，参与一系列物质代谢和能量代谢过程，对动物机体的生长发育和肉品质改善具有重要作用[21]。镁是动物机体生长发育不可或缺的元素之一，镁元素沉积可以改善禽肉品质[22-23]。武书庚等[24]研究发现，动物机体的镁元素含量随日龄增加迅速升高，在骨骼中大量沉积，只有25%左右的镁元素沉积在肌肉中，与本研究结果基本一致。钾是排在动物体内第三位的常量元素，是机体细胞内代谢的主要阳离子，对机体维持体液的酸碱平衡和渗透压以及保持神经、肌肉反应和细胞稳态具有重要作用[25]。铁参与整个动物机体的能量和蛋白质代谢[26]。研究表明，动物体内脾脏和肝脏组织中的铁元素含量最高，骨骼肌中铁元素的含量仅为肝脏组织的5%～10%[27]。本研究中胸肌和腿肌组织中的铁元素含量约为肝脏组织中的3%～27%，与上述研究结果基本一致。锌与白蛋白结合经血液循环首先运送到肝脏中，随后转运到机体的各个组织和器官中，绝大部分转运到骨骼中[28]。肝脏是锌的主要代谢器官，周转速度较快，而骨骼中的锌代谢速度较慢，含量较高[29]。本研究中锌元素沉积量的大小排序为：胫骨>肝脏>腿肌>胸肌>背皮，与上述研究结果相同。硒是动物机体必需的微量元素[30]，对动物机体的免疫应答和氧化反应等具有重要作用[31]。Burk等[32]研究表明，硒主要分布在肝和肾中，与本研究结果基本一致。

本研究发现，镁与钾元素的沉积规律在所有组织中基本一致，且在润州凤头白鸭的5个生长阶段均呈高度正相关，表明镁元素和钾元素协同促进机体正常代谢，提高动物的肉品质，可作为联合指标用于润州凤头白鸭优质品系的精准选育，提高选育效率。综合5种矿物元素在不同组织中的沉积规律发现，在胸肌、腿肌和肝脏组织中，几乎所有矿物元素的含量在49—63日龄时达到峰值并趋于稳定，为润州凤头白鸭最佳出栏日龄的选择提供基础数据支撑。

3.2 基因表达水平与矿物元素相关性

TRPM家族有8个基因，其中TRPM6和TRPM7两个基因对Mg2+的通透性较高，对维持细胞内Mg2+稳态具有重要作用。Voets等[33]研究表明，TRPM6基因可以使Mg2+的亲和力比对Ca2+的亲和力高5倍以上，上皮细胞可以吸收全部或部分的Mg2+。滕飞翔等[34]研究表明，TRPM7可能在成年大鼠肾脏细胞内外Mg2+转运过程中发挥重要作用。Na+/K+-ATP酶是细胞跨膜离子梯度的主要中介，其作用是维持机体的钠离子和钾离子平衡[35]。Mallakh等[36]研究表明，当红细胞Na+/K+-ATP酶活性降低时，ATP1A1可以将K+泵入细胞，将Na+泵出细胞，提高细胞中K+的浓度。Blostein等[37]研究表明，ATP1B1决定了K+通道的通透性。铁是血红蛋白的重要组成成分，主要以铁蛋白和含铁血黄素形式存在于肝脏组织中，铁蛋白是动物体内极其重要的一种储铁蛋白。He等[38]研究发现，铁蛋白基因FTH1表达可以产生聚铁效应，有利于铁元素在动物体内的沉积。细胞膜上的ATP酶对维持细胞稳态具有重要作用。韩军花等[39]研究表明，锌对细胞膜上的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性均有影响，当锌浓度过高或过低时，ATP酶活性均有不同程度的降低。硒主要以硒蛋白和含硒蛋白的形式存在于动物体内。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是动物体内第一个被发现的也是最为丰富的硒蛋白。GSH-Px家族包含了GPX1、GPX2、GPX3、GPX4和GPX6在内的5种亚型，其中GPX1参与了体内抗氧化防御机制，而GPX4参与了机体生物膜抗氧化防御系统[40]。

结合5种矿物元素在肝脏组织中沉积规律折线图发现，相关基因的表达水平随日龄呈动态变化，与矿物元素沉积具有一定的相关性。其中，TRPM7的基因表达水平与镁元素沉积呈显著正相关(P<0.05)，可作为镁元素含量检测关键标志基因。

本研究以润州凤头白鸭为研究对象，探究了不同组织中的主要矿物元素随日龄增加的沉积规律以及相关基因的表达水平。镁元素和钾元素可作为联合指标用于润州凤头白鸭优质品系的精准选育；49—63日龄可作为优质润州凤头白鸭最佳出栏日龄的参考日龄；TRPM7基因可作为镁元素含量检测关键标志基因。本研究结果为小体型优质肉鸭选育指标和选育效率提供了一定的理论依据。