一株海参肠道益生菌的分离及鉴定

2021-09-11何启欣刘长建

科学技术创新 2021年25期

何启欣刘长建*

(大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600)

海参自古以来被誉为“海产八珍”之一，具有滋补强身的作用，可与人参媲美[1]。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、非病原性、革兰氏染色阳性细菌的总称[2]。乳酸菌对人体肠道功能和免疫调节带来的良好作用[3]，近年来益生菌的应用领域一直在不断拓展，也正逐步得到研究者的关注[1-4]。本研究从海参肠道中的乳酸菌研究奠定基础，为应用于农产品加工,增加食品的货架期，改善因化学防腐剂带来不良口感。

1 材料与方法

1.1 实验材料及培养基

大连金石滩海域捕捞的海参，冰盒保存带回实验室，立即取肠道内容物。试验采用MRS 培养基。

1.2 仪器设备

本研究用到的主要设备有梯度PCR (TC5000，英国TECHNE 公司)、组织DNA 快速制备仪(Fast Prep-1，美国MP公司)、超微量分光光度计(P-330-31，德国Implen 公司)、电热恒温培养箱(DNP-9052，上海精宏)、高速冷冻离心机(S3026 2157，日本三洋)、显微镜(N300M 中国永新)。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

取1.0g 肠道内容物于MRS 培养液中37℃静置富集24h。采用连续稀释法，取稀释倍数为10-5、10-6和10-7稀释液分别涂布于MRS 固体分离培养基，37℃静置培养48h，挑去生长良好的菌落。部分菌苔放入过氧化氢溶液中，观察是否有气泡，筛选没有气泡的，即过氧化氢酶阴性的菌株进一步纯化[5]。

1.2.2 菌株的菌落形态、细胞特征和生理生化鉴定

将纯化好的菌株，接种于MRS 固体培养基上，静置培养48h，观察并记录其菌落特征，包括菌落边缘是否整齐、菌落颜色、大小、厚度、表面等形态学特征。然后根据《乳酸细菌的分类鉴定与实验方法》[6]，进行了淀粉水解实验、精氨酸产氨试验、硫化氢的产生、乙酰甲基甲醇(V-P)、碳水化合物发酵产酸等生理生化试验。

1.2.3 16S rDNA 分子生物学鉴定

将乳酸菌HE04 在固体培养基上培养48h，用竹签刮取少量菌体，放入灭菌小管里，微波法[7，8]提取菌体总DNA。用1%琼脂糖凝胶120V 电泳30min，紫外观测台检测。

以将提取的基因组DNA 作为模板，进行PCR 扩增。采用通用引物F27 和R1492，总体积50uL。PCR 扩增条件为：95℃先预热变性4min，再进入30 个循环，分别为95℃变性30s，55℃退火30s,72℃复性2min，最后72℃延伸10min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶120V 电压下，电泳30min 电泳，把凝胶放在紫外观测台上进行观察。

2 实验结果与分析

2.1 菌落特征及菌体形态观察

从海参肠道分离得到13 株过氧化氢酶阴性的疑似乳酸菌，经过三次纯化培养，最终筛选得到一株生长良好的菌株，命名为乳酸菌HE04，革兰氏染色后的显微镜下观察，革兰氏染色为阳性，细胞为杆状(见图1)。在MRS 固体平板上培养48h 后，菌落呈乳白色、表面光滑、易挑取、边缘园整、隆起、菌落直径小于0.5mm。

图1 菌株HE04 革兰氏染色

2.2 乳酸菌的生理生化特征

参照文献[6]中的方法，乳酸菌HE04 做进一步生理学特征试验。结果显示过氧化氢酶阴性、精氨酸产氨实验、硫化氢的产生和V－P 实验均为阴性；能水解淀粉、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、果糖和七叶苷，不能利用肌醇。(表1)

表1 菌株HE04 的生理生化结果

2.3 乳酸菌的分子生物学鉴定(16S rDNA)

提取的总DNA 在琼脂糖凝胶后的紫外观测台检测结果，可以看到条带清晰，满足下一步扩增要求。以提取的基因组DNA作为模板，进行PCR 扩增，产物在1500 bp 位置有清晰条带，说明PCR 条件合理(图2)，能够满足测序要求。

图2 菌株HE04 的16S rDNA 的PCR 产物电泳图

16S rDNA 的PCR 扩增产物委托宝生物公司进行测序，测序序列结果上传到NCBI 核酸数据库中，与已知的相关序列进行对比，从结果分析可知分离到的乳酸菌HE04 的16SrDNA 序列与菌株Lactobacillus plantarum 的16S rDNA 序列的同源性最高(见图3)，同源性达到100%。结合该菌株的的菌落形态和细胞形态特征、生理生化特征，乳酸菌HE04 可鉴定为植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)。