明串珠菌T7产细菌素的特性及共培养对其细菌素产生的影响

生龙娜雍 罗强 关仁梅 张明 刘巧 罗璠

【摘要】前期研究筛选到高产抑菌物质的明串珠菌T7，为探究T7产生的抑菌物质特性及产量，本实验测定了菌株的生长曲线和pH曲线，通过硫酸铵盐析粗提抑菌物质，测定了代谢曲线和抑菌特性。以金黄色葡萄球菌为共培养菌，测定了在不同时间点进行共培养对T7产抑菌物质的影响。结果表明：T7的抑菌物质产生与菌体生长相关，在24h时产量最高。T7所产抑菌物质对除α-淀粉酶以外的蛋白酶均有部分敏感性，在pH5.0-10.0均有较高的稳定性。当其与金黄色葡萄球菌共培养时，均能刺激T7产生更高产量的抑菌物质，其中在T7单独培养至24h时进行共培养刺激产生的抑菌物质最多。

【关键词】生长曲线;抑菌特性;代谢曲线;共培养

【中图分类号】R-1【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）04-001-04

引言

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类小分子质量、安全无毒的抗菌肽，它能抑制或杀死食物中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌且具有良好的热稳定性[1-2]。根据细菌素的理化性质以及氨基酸结构的不同，可将其分为四类但目前只有乳酸链球菌素（nisin）被允许广泛应用于食品防腐和保鲜，主要原因是其他细菌素大多存在产量低、酸碱耐受性差、抑菌时效短、抑菌谱窄和抑菌机理不明确等因素[3]，不足以满足工业化生产要求。

如何提高乳酸菌细菌素的产量始终是乳酸菌研究领域的热点，通常伴随细菌素合成的是一簇基因的共同表达，可通过细菌素自诱导、共培养诱导等一系列条件来启动产乳酸菌细菌素相关基因的表达，从而利用诱导物的调控来提高乳酸菌细菌素产量。易华西[4]等以发酵上清液、吸附-解吸法得到的发酵液和阳离子交换得到的发酵液分别加到培养体系中，三种不同条件下得到的上清液均对细菌素的合成有刺激作用，说明细菌素的产生存在自我诱导现象。塔娜[5]等研究了粪肠球菌在不同菌体密度下细菌素H抑菌活性的变化规律，證实了细菌素H受到了群体感应机理的调控。

乳酸菌T7是一株前期从发酵乳中分离得到一株具有较强抑菌能力的乳酸菌株T7。本研究主要拟分析其产生的抑菌物质特性，并采用共培养的方法，探讨在种群压力下其抑菌物质产生有无变化，希望寻找刺激菌种高产细菌素的方法，以期为乳酸菌T7细菌素的进一步开发利用提供前期技术支持。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验菌株

明串珠菌T7分离自藏区传统发酵酸乳，前期实验证明其高产抑菌物质;，金黄色葡萄球菌ATCC 25923购于成都鹏世达实验用品有限公司。

1.1.2试验试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司;硫酸铵，聚已二醇-20000、甘油、Tris-HCL、乳酸、盐酸、冰乙酸、氢氧化钠：上海生工生物工程有限公司;蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α—淀粉酶：德国 Biofroxx公司。所用试剂均为分析纯。

培养基：MRS液体培养基，营养肉汤培养基，胰蛋白胨大豆液体（TBS），培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

ST16R高速冷冻离心机：赛默飞世尔有限公司;R40-IIB2超净工作台：上海苏净实业有限公司;Tanon2500 凝胶成像系统：中国天能公司;GI54DW高压蒸汽灭菌锅：厦门致微仪器有限公司;GH6000电热恒温培养箱：天津泰斯特设备有限公司;UV1900紫外可见分光光度计：上海佑科仪器;ELX-800酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌种的活化

取冻存的明串珠菌T7以5%接种量接种于灭菌MRS液体培养基中，30℃活化24 h。

取保藏金黄色葡萄球菌菌液，以 2%接种量接入5 mL 灭菌胰蛋白胨大豆液体（TBS）培养基，30 ℃培养10 h备用。

1.3.2乳酸菌T7生长曲线及pH曲线测定

取活化后的明串珠菌T7，以5 %接种量接种于100 mL的灭菌MRS液体培养基中，30 ℃培养箱中培养36 h并进行间隔取样，在600 nm波长下测定OD值，同时使用pH计准确测定pH值。

1.3.3T7发酵上清液制备

取活化菌株以5 %的接种量于100 mLMRS液体培养基中30 ℃静置培养适当时间，在4 ℃ 6000 r/min离心10 min，去除菌体细胞，制备发酵上清液。

1.3.4盐析法制备粗提物

在上清液中加入硫酸铵至终浓度达到60 %，4 ℃静置过夜，10000 r/min 4 ℃离心10 min收集沉淀，用10 mL PBS重溶，转至截留量3400Da的透析袋除盐后浓缩至10ml保存。

1.3.5明串珠菌T7细菌素的特性及共培养的影响

1.3.5.1抑菌活性测定

采用平板打孔法测定抑菌活性，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌。

1.3.5.2抑菌物质产生曲线

在1.3.2的菌株培养过程中，在0h，8h，12h，16h，20h，24h，30h分别取一瓶培养液，制备粗提物，测定不同培养时间抑菌物质的产生量。

1.3.5.3pH稳定性检测

取粗提取物10ml，均分为10份，将其pH调为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0共10个梯度，室温处理1h后调至pH6.0，测定抑菌活性。

1.3.5.4不同酶对粗提物抑菌活性的影响

取7ml素粗提物，均分为7份，将其中6份调节pH值到各酶的最适pH，加入1mg/ml的酶液，室温处理1h，然后调节pH至6.0，以经相同处理但不加入酶的样品为对照做抑菌活性测定。

1.3.5.5不同共培养条件对抑菌物质产量的影响

乳酸菌T7培养过程中在不同培养时间点加入金黄色葡萄球菌共培养，添加时间点如下表。其中，金黄色葡萄球菌（OD600=1.0）添加量为0.5﹪，以不添加金黄色葡萄球菌作为空白对照，培养至36h测定抑菌活性。

1.4.0数据处理

数据以3 次重复的表示，使用SPSS v24.0对数据进行统计分析，Graphpad prism 8.0软件绘图。

2结果与分析

2.1T7的生长曲线图和pH曲线图

如图1所示：乳酸菌T7接种后，约在4h进入对数生长期，在24h左右进入稳定期。而发酵液的pH整体呈现持续下降的趋势，在对数生长期产酸量大，pH下降明显，进入稳定期后pH变化趋缓。多数研究表明，细菌素的产生与其菌株生长具有关联。 章检明等[6]报道的植物乳杆菌 B23培养时间至12-16 h，p H=7时，最有利于细菌素Lac-B23合成;荣梓娴等[7]报道的产细菌素屎肠球菌 TRS5在37℃，培养至24 h，pH为6.5时，其细菌素生成量达到最大。

2.2代谢曲线测定

将不同时间段取出的培养液处理得到的粗提取物进行抑菌试验，结果如图2所示：乳酸菌T7細菌素粗提物在24h时产生的抑菌物质最多，随着培养时间增长，其，抑菌物质产量略有下降。研究表明，不同来源细菌素达到最大产量的时间差异较大，张炎等[8]报道的Lactobacillus paracasei细菌素 24h发酵产量最高，高鹏等[9]报道的Lactobacillus plantarum发酵 12h 最大，Perumal[10]等研究的Enterococcus faecalis 细菌素在20 h产量达到最大。

2.3抑菌活性的pH稳定性

T7产生的抑菌物质的pH稳定性结果如图3：从结果可知，乳酸菌T7发酵液粗提物较稳定，在pH 2-11的范围内均有抑菌活性。在pH5.0-10.0的范围内稳定性最高，在强酸条件下，稳定性最差。Kumar等[11]从芒果泡菜中筛选到的干酪乳杆菌LA-1所产细菌素在pH酸性条件下稳定性较差，在pH为6.5时稳定性达到最强。张明[12]等研究屎肠球菌SC-Y112发酵上清液在不同pH条件处理下的抑菌效果是该菌株所产的抑菌物质在弱酸性条件下较稳定，而在碱性条件下不稳定。

2.4酶的影响

选取α-淀粉酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶在最适条件下分别对乳酸菌T7抑菌物质粗提液处理后，结果如图4所示：α-淀粉酶与对照无明显变化，说明该粗提物里无糖类成分，其他蛋白酶处理后，抑菌活性均有下降，说明粗提物中含有蛋白质成分，初步证明该抑菌物属于细菌素类。结果显示粗提物用蛋白酶k处理后，仍具有一定抑菌活性，说明该物质中含有非蛋白成分。因不同的细菌素氨基酸组成与结构存在差异，所以其对不同蛋白酶的敏感性也有差别。如Lactobacillus plantarum[13]细菌素活性对胃蛋白酶、α-凝乳酶有较强的耐受性，Enterococcus faecalis[14]所产细菌素对胰蛋白酶不敏感，但对胃蛋白酶和蛋白酶 K敏感。

2.5不同共培养条件对细菌素产量的影响

由图5结果可见，在不同时间加入金黄色葡萄球菌进行共培，均促使T7的抑菌物质产量增加，在T7培养到24 h加入金黄色葡萄球菌共培后，T7最终产生的抑菌物质的量最大，其抑菌圈直径达到了22.1±0.9。许多研究证明，细菌物质的产生依赖于菌体密度，受到群体感应系统的影响，王筱梦[15]的研究结果也证实了这一点。

3结论

随着对细菌素的深入研究， 生物防腐剂广泛应用于食品工业成为大趋势，这不仅会给消费者提供更安全更健康的食品， 而且会为食品工业带来一场重要的变革。本研究从乳酸菌T7中初步提取出其产生的抑菌物质，对其抑菌特性进行了研究，证明该种抑菌物质具有蛋白质性质，有较好的pH稳定性，该种抑菌物质的代谢与菌体生长直接相关，可能受到菌体密度的调节，当T7与金黄色葡萄球菌共培养时，其抑菌物质的产生会受到诱导，提示T7可能存在群体感应系统。

本研究对细菌素的抑菌作用进行了部分探讨，但细菌素的作用机制、合成及分泌运输还可进一步研究。虽然细菌素具有高效性、安全性、应用范围广、其添加不改变产品风味和病原菌对其不易产生抗性等诸多优点，也已广泛应用于医学治疗、食品防腐和饲料业等，但其产量低、易失活、敏感细胞抗性的出现、寻找专一性的细菌素等诸多困难问题有待我们去探究解决。

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作者简介：生龙娜雍（1997-6），性别：女，民族：藏族，籍贯：四川康定，学历：在读硕士，单位：西南民族大学，研究方向：食品微生物，单位所在省市和邮编：四川成都 610041

基金项目：中央高校基本科研業务费专项资金优秀学生培养工程项目（0217-3300220345）

通讯作者：罗璠，副教授，E-mail： luofany77@163. com

1.西南民族大学 食品科学与技术学院 四川 成都 6100412.西南民族大学 畜牧兽医学院 四川成都 610041