简述SSR分子标记技术的现状

王振 于雪

摘要：中国是世界最大的农产品生产国和消费国，种子产业凭借其高附加值、高科技含量以及低污染、低能耗的特点端坐在大农业产业链的最上端。现代育种技术迅猛发展，品种的选育和推广速度越来越快，大量品种的被审定和推广。由于种子具有较高的科技含量和商业价值，某些种子生产和经营者唯利是图，以劣质种子冒充优质种子更甚者窃取他人的材料进行种子生产，严重损害其他种子生产者和消费者的利益，甚至给国家带来巨大损失。在当前水稻品种数量众多并且差异较小的情况下，建立一种准确、可靠的品种鉴定方法，对维护种子生产经营单位品种产权和经济利益具有重要意义。

关键词：SSR分子 种子纯度

种子纯度是评价种子质量的主要指标。在种子生产中，由于忽视种子真实性和品种纯度检验 ，伪劣掺假种子伤农事件时有发生，给农业生产造成了不可弥补的损失。因此，对种子纯度进行快速、准确、有效的鉴定显得十分重要。

纯度是指品种在特征特性方面典型一致的程度，用该品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。种子纯度是种子质量好坏的衡量标准之一，对种子纯度检测是防止良种混杂退化、提高种子质量和产品品质的必要手段。目前检测种子纯度的方法有很多种，公认最直观准确和最具权威性的种子纯度检测方法为田间小区种植鉴定，一般需要一个生长季节才能取得结果，受季节和时间限制，严重滞后于农业生产用种进程。较多学者通过与田间种植鉴定结果比较分析发现，利用 SSR分子标记技术能准确鉴定种子纯度。当前，SSR分子标记技术已广泛应用于种子纯度检测。SSR 标记由于具有重复性好 、遗传上呈共显性 、数量丰富、多态性高、引物序列易交流、结果稳定可靠等优点，已成为种子纯度鉴定的一种理想分子标记方法。

一、 SSR 分子标记原理

SSR 即简单序列重复 ，不同品种基因组DNA中 ，存在着能够稳定遗传的简单重复序列（SSR）重复次数的差异，这种差异可以通过从种子、幼苗等组织中提取DNA，用SSR引物进行擴增 ，经电泳获得 DNA 指纹图谱加以区别。利用该原理和 SSR 标记技术，在分子水平上鉴定品种纯度也成为必然的发展趋势。SSR 分子标记技术用于杂交种子纯度鉴定 ，是基于F1杂交种子（父母本杂交后代）具有父母本共同的遗传基础，而父母本之间又在特定的 SSR位点存在多态性，通过筛选引物对样品 DNA 进行 PCR 扩增，凝胶电泳后观察不同DNA 谱带类型 ，F1具有双亲互补的带型，很容易将杂交组合与其亲本及其他混杂种子分辨开来。

二、SSR 分子标记鉴定纯度技术要点

2.1 DNA 提取

多数研究者以新鲜叶片或发芽幼苗为材料来提取样品中 DNA，提取的 DNA 质量应符合 PCR 扩增的要求，常见的DNA 提取方法主要有以下几种 ：CTAB 提取法、SDS 提取法 、磁珠提取法、碱煮法。CTAB 提取法：DNA 质量高、得率高，储存时间长，成本低，但程序复杂;SDS 提取法：DNA 质量高，储存时间长，程序较复杂;磁珠提取法：DNA 质量高、得率较低，储存时间长，程序较简单;碱煮法质量较低，存储时间短、程序简单，成本极低。

2.2 PCR 扩增

2.2.1 引物筛选。

引物筛选原则 ：一是杂合率高 、具有双亲共显性;二是多态性高、区分异品种能力强;三是综合考虑多重电泳组合潜力、碱基基序重复、扩增效果好（特异性扩增强、非特异性扩增少、引物扩增稳定、重复性好）。

2.2.2 PCR 扩增反应体系。

通常 PCR 扩增在 10 μL 反应体积下进行，包含 DNA 聚合酶、SSR 标记引物、模板 DNA、d NTP、10 倍 PCR 反应液，其中选用的引物为在父母本间具有差异性的引物 。

2.2.3 PCR 扩增反应程序。

94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s，60 ℃退火 35 s（不同引物退火温度有别 ），72 ℃延伸 45 s，共进行 35 个循环，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存，经过 35 个循环后，单个 SSR 位点特定片段可得到几百万倍的扩增，从而可在凝胶上显现出来。

2.3 PCR 扩增产物检测。

目前，应用于 SSR 扩增产物检测的方法主要有温度扫描凝胶电泳、DNA 测序、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、普通琼脂糖凝胶电泳、phor 琼脂糖凝胶电泳、荧光标记毛细管电泳等。

2.4 数据记录与统计。

三、分子标记技术在实际应用中存在许多问题

3.1分子标记技术成本较高

分子标记技术由于分子生物学、数学统计学等专业知识与技术，其在具体实践过程中就会出现操作成本过高的现象。此外在农作物种子的检测与种植过程中，涉及的分子标记检测对象数量巨大，工作人员在进行种子标记行为与后期种子状态跟进过程中工作量巨大，进而导致分子标记技术参与种子检测时的各项应用成本较高。此外分子标记技术成本较高将会导致分子标记技术的应用面较窄，一些预算较少的农作物种植领域会放弃这一高成本的种子检测技术。分子标记技术的操作成本较高导致该技术的替代性不得已完全，因此为提升技术在农作物种植领域具体的应用率应该采取一定措施降低既降低分子标记技术的应用成本。

3.2分子标记技术具体操作过程不规范

在分子标记技术的具体操作工程中，需要专业技术工作人员借助相应的基础设施来对大量种子类的检测对象进行标记检测，同时在标记后的观察阶段，需要专业人员依照相应规定的时间对标记种子进行全方位的检测。这样繁琐庞大的工作会直接导致工作人员在分子标记技术的具体操作过程中出现各类不规范的现象，违反规定的操作会直接降低种子检测的准确性。

四、结论

种子是农业种植最根本的生产资料，是实现农业科技进步的载体，其质量直接关系到农民利益，做好种子质量鉴定工作是把控农业生产安全的重要措施。这就需要运用快速、准确检测种子质量的方法，它对于种子质量标准化、新品种注册、假种辨别、产权登记保护都具有十分重要的作用。分子标记技术在种子的纯度鉴定方面有很大的用途，进一步普及应用分子标记技术在农作物种子检测中的实际应用，能够提升农作物种子的监测速率和检测质量。

1.庆安县农业综合行政执法大队 2.绥化市种业技术服务中心