乳酸杆菌对新生鼠和成年鼠辅助性T细胞1/辅助性T细胞2平衡及肺树突状细胞表型的影响

谢娜，刘崇海，皮光环，雷勋明，蔡艳，刘昊昊，李小林

(1.四川省妇幼保健院，四川成都 631000；2.川北医学院，四川南充 637000)

近几十年来过敏性疾病发病率逐年增加，已成为严重的公共问题和疾病负担[1]。我国婴幼儿过敏性疾病患病率正逐渐接近发达国家和地区水平[2]。大多数过敏性疾病都从儿童开始发病，因此早期预防意义重大[3]。动物模型证实肠道菌群对免疫系统发育有着重要意义[4]。有研究显示过敏患儿肠道菌群肠球菌和乳酸杆菌数量明显减少[5]，提示肠道菌群与过敏性疾病密切相关。人类生命早期辅助性T细胞(Th)1/Th2平衡以Th2为优势细胞，已有的研究显示包括乳酸杆菌的益生菌可以促进Th1分化[6]，如果早期进行乳酸菌干预，是否可以改变Th1/Th2平衡状态，进而达到预防过敏性疾病的目的？因此，我们在新生小鼠和成年小鼠予以乳酸杆菌干预，探讨乳酸杆菌干预对新生鼠和成年鼠Th1/Th2平衡和肺树突状细胞表型的影响，为生命早期乳酸杆菌干预预防过敏性疾病的发生提供参考。

1 资料和方法

1.1 材料

清洁级BALB/c小鼠分笼饲养于标准饲养笼，孕鼠怀孕20 d后所产新生鼠在同样环境中饲养。本实验使用的乳酸杆菌是从正常人粪便分离所得，通过革兰染色、触酶实验，API-CH50系统鉴定。将乳酸杆菌接种于乳酸杆菌选择性(LBS)培养基，置于37 ℃厌氧培养72 h后，收集乳酸杆菌，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，血球计数池计数并将乳酸杆菌调整为109CFU/mL浓度。

1.2 方法

1.2.1 乳酸杆菌处理 新生鼠从出生后连续7 d每天经口给予109CFU/mL浓度乳酸杆菌10 μL，利于乳酸杆菌定植。成年鼠选取满6周的小鼠连续7 d每天经口给予109CFU/mL浓度乳酸杆菌50 μL，实验第8天进行盲肠内容物培养以确定乳酸杆菌肠道定植情况。

1.2.2 实验分组 新生鼠和成年鼠各40只，小鼠分为两部分，第一部分40只，用于肠道菌群计数，其中新生鼠20只，随机分为乳酸杆菌组和对照组各10只。乳酸杆菌组出生后连续口饲乳酸杆菌7 d，对照组用等量生理盐水代替乳酸杆菌进行实验。第8天小鼠处死后取盲肠内容物作乳酸杆菌培养计数。成年鼠20只同样分为乳酸杆菌组和对照组，处理同前。第二部分40只小鼠分组同第一部分，在最后1次口饲乳酸杆菌后3周，取眼眶血的血清用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，取肺组织制备单个细胞悬液用于流式细胞仪检测。

1.2.3 细菌培养 参考文献[7]方法，取盲肠内容物加无菌稀释液，稀释成10-6～10-1稀释度，进行肠杆菌(伊红美兰EMB培养基)、肠球菌(EC培养基)、乳酸杆菌(LBS培养基)、双歧杆菌(BS培养基)培养和计数。结果单位CFU/g。

1.2.4 细胞因子检测 血清细胞因子浓度检测采用ELISA试剂盒。小鼠干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)试剂盒购于R&D公司(USA)。白细胞介素4(IL-4)购于Bender公司(Austria)。按试剂说明书进行操作，ELISA酶标仪于450 nm处检测吸光度。

1.2.5 流式细胞仪检测 小鼠肺研磨后，300目筛网过滤，制成单个细胞，取10 mL经红细胞裂解液处理10 min后，PBS洗2次，血球计数池计数后，取两份等体积含细胞数为106悬液分别加入两支试管。阳性管加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗小鼠CD11C和E/Cy5标记的单克隆抗小鼠CD8α以及PE标记的单克隆抗小鼠主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ类分子抗体，阴性管加入FITC标记的单克隆抗小鼠CD11C以及PE/Cy5和PE标记的同型对照抗体(抗体均为BioLegend公司产品)，每种抗体各加1 μg，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗 3次，上机检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 肠道菌群检测

通过口饲乳酸杆菌，乳酸杆菌干预的新生鼠乳酸杆菌数量较对照组增加，而肠球菌和肠杆菌数量降低(P<0.01)；乳酸杆菌干预的成年鼠肠道乳酸杆菌数量增加(P<0.01)，但肠道肠球菌和肠杆菌数量变化差异无统计学意义，提示新生鼠肠道菌群相对于成年鼠更容易受环境因素影响。见表1。

表1 两组肠道菌群数量比较 log10n/g

2.2 免疫指标检测

乳酸杆菌干预的新生鼠IFN-γ和IL-10水平较对照组高(P<0.05)，两组IL-4水平比较差异无统计学意义。乳酸杆菌干预的成年鼠IFN-γ、IL-4和IL-10水平与对照组比较差异无统计学意义。提示乳酸杆菌干预对新生鼠有影响，可以提高IFN-γ水平，促进Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，但乳酸杆菌干预对成年鼠没有明显影响。见表2。

表2 两组小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-10水平比较 pg/mL

2.3 肺树突状细胞表型检测

乳酸杆菌干预的新生鼠肺部CD11c+CD8α-水平为92.34%±0.94%，较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；同时新生鼠干预组CD11c+CD8α+水平较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)；提示乳酸杆菌干预可以促使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。对照组新生鼠肺部仅11.48%±1.73%的树突状细胞(DC)表达MHCⅡ类分子，说明外周组织中以未成熟DC为主，经过乳酸杆菌干预后，新生鼠肺部14.03%±1.14%的DC表达MHCⅡ类分子，较对照组明显增加，提示乳酸杆菌可以刺激肺部DC成熟。成年鼠乳酸杆菌干预组CD11c+CD8α-、CD11c+CD8α+和CD11c+MHCⅡ+水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组小鼠肺部DC亚型和成熟度的流式检测水平比较 %

3 讨论

通过给小鼠口饲乳酸杆菌，肠道菌群检测显示无论新生鼠还是成年鼠，乳酸杆菌数量均明显增高，但对于其他肠道菌群的影响，两组小鼠反应有差异。新生鼠乳酸杆菌数量增加，明显影响肠道的肠球菌和肠杆菌数量，而成年鼠虽然乳酸杆菌数量明显增加，但对其他肠道菌群影响不大，提示生命早期肠道菌群不稳定，很容易被环境因素干扰。

Th1/Th2平衡在过敏性疾病中至关重要[8-10]。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，IL-4可以促进B细胞完成IgE抗体类型转化，在过敏性疾病中发挥重要作用[11-12]。Th1分泌IFN-γ可以抑制Th2的分化和功能[13]。调节性T细胞(Treg细胞)是机体对T细胞活化的一种负反馈调节机制，将T细胞参与的免疫反应控制在一个适当的范围内，不对机体造成损伤，通过分泌可溶性分子如IL-10、转化生长因子等调节免疫功能。通过对相关细胞因子水平检测发现，成年鼠口饲乳酸杆菌后对IL-4、IFN-γ和IL-10没有明显影响，但是在新生鼠乳酸杆菌可以明显提高IFN-γ和IL-10水平，本研究结果显示乳酸杆菌干预对IL-4的影响不大。分析原因可能是成年鼠已经接受多种抗原刺激，肠道菌群和免疫系统均发育成熟，不易受环境影响。相关研究显示，婴幼儿出生后数小时细菌开始在肠道定植，约3岁时形成与成人相似的稳定肠道菌群构成[14]，而新生鼠出生后，无论是肠道菌群还是免疫系统均处于逐渐发育的过程，在此过程中对外界刺激会出现不同的反应，两者均容易受外界因素影响。国内有研究显示，嗜酸乳杆菌La28在干预第14天和第28天时小鼠血清Th2因子IL-6含量降低，嗜酸乳杆菌6091干预28 d时血清IL-6含量降低，而植物乳杆菌LP45、鼠李糖乳杆菌GG对小鼠Th1/Th2平衡没有影响[15]，提示不同乳酸杆菌菌株对免疫系统的影响有所不同[16]。

DC是功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presen-ting cells，APC)，是唯一可激活初始T淋巴细胞的APC[17]。DC高水平表达MHC Ⅱ类分子可表达参与抗原摄取和转运的特殊膜受体[18]；有效摄取和处理抗原，然后迁移至T细胞区；提高抗原提呈效率，少量抗原和DC即可激活T细胞。体内DC按其发育程度可分为成熟DC和未成熟DC。正常情况下，体内绝大多数DC处于未成熟状态，未成熟DC有很强的吞噬能力，低表达MHCⅡ和共刺激分子如CD80、CD83或CD86，有很强的外周组织监视能力[19]。成熟DC高表达MHCⅡ类分子和共刺激分子具有很强激活T细胞的能力。不同DC亚型对Th1/Th2平衡影响不同，CD8α-DC则可促进Th2发育，CD8α+DC则促进Th1分化[20]。

本研究结果显示，成年鼠乳酸杆菌干预对小鼠DC亚型和成熟度均没有明显影响，但是在新生鼠模型中，乳酸杆菌干预可以对两者均产生明显的影响，表现为乳酸杆菌干预可以上调CD11c+CD8α+DC表达，下调CD11c+CD8α-DC表达，同时CD11c+MHCⅡ+表达较对照组明显增高。再次说明乳酸杆菌可以促进机体向Th1优势发展，同时可以促进DC的成熟度。而相关研究提示益生菌可以影响T细胞亚群分化，促进Th1介导的免疫反应，进一步抑制IgE抗体的产生从而调节过敏反应[21]，也有相关研究提示生命早期乳酸杆菌干预可以促进新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移[22]，对成年鼠免疫状态没有影响[23]，可能是生命早期乳酸菌干预可以预防过敏性疾病的机制。

综上所述，乳酸杆菌干预可以提高新生鼠IFN-γ和IL-10水平，上调CD11c+CD8α+DC、CD11c+MHCⅡ+表达，下调CD11c+CD8α-DC表达，而在成年鼠中没有明显变化，说明乳酸杆菌干预对新生鼠的影响与成年鼠有一定差异，生命早期可以促进新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，而对成年鼠没有影响。