克雷伯氏菌产β-半乳糖苷酶的异源表达及低聚半乳糖合成工艺优化

李宗显，许丽亚，朱运平1，*，郦金龙2，，李秀婷

（1 北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京 100048 2 北京工商大学 食品质量与安全北京实验室 北京 100048 3 北京工商大学食品与健康学院 北京 100048）

低聚半乳糖（GOS）是一种功能性低聚糖，具有提高肠道对钙等矿物质的吸收，改善脂质代谢，防止便秘等益生功能[1-3]。因低聚半乳糖在天然的食物中含量较低，益生效果不明显，故往往需要额外补充。酶法合成低聚半乳糖因反应条件温和，产物特异性好而备受关注，其中β-半乳糖苷酶为酶法合成过程中的关键酶[4-6]。

β-半乳糖苷酶，简称乳糖酶，兼具水解及转糖苷活性，于自然界中广泛存在[7-10]，其在乳糖降解、GOS 酶法合成及生物传感器等领域发挥重要的作用。目前β-半乳糖苷酶来源主要有克鲁维酵母菌、乳酸菌、环状芽孢杆菌及米曲霉等[10-13]。依据氨基酸序列相似性，β-半乳糖苷酶分别属于糖苷水解酶家族GH-1、GH-2、GH-35、GH-42、GH-59 和GH-147。一般来说GH-35 来源最丰富；GH-2 以嗜冷，嗜温菌株为主，水解和转糖苷作用均较好；GH-42 存在于嗜热微生物中，对半乳糖相关多糖的利用效果良好[11，14]。

虽然研究者对β-半乳糖苷酶开展了大量研究，但是仍存在着表达力差，转糖苷活力较低，不易获取等问题[15-16]。本研究团队前期筛选获得一株产β-半乳糖苷酶的克雷伯氏菌，该酶具有较好的转糖苷活性。本文首次对克雷伯氏菌来源的β-半乳糖苷酶基因进行重组表达，成功得到具有优良转糖苷活性的β-半乳糖苷酶，并探究其酶法转化乳糖合成GOS 的工艺条件，为丰富β-半乳糖苷酶资源及低聚半乳糖制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-半乳糖苷酶基因（lacZ）由课题组前期从多地土样中筛选出的克雷伯氏菌B5582Y 中分离得到。

限制性内切酶 NcoI，XhoI，美国BioLabs 公司；质粒pET28a（+），T4DNA 连接酶，La Tap 扩增酶，2×GC Buffer I，日本TAKARA 公司；异丙基硫代半乳糖苷 （Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，Xgal），氨苄，卡那霉素，北京Biotopped 公司；细菌DNA 提取试剂盒 （100），胶回收试剂盒（200），美国OMEGA 公司；琼脂糖，西班牙Biowest 公司；BL21 （DE3）感受态细胞，北京TIANGEN 公司；PCR 扩增引物，由北京奥科鼎盛合成；色谱乙腈，美国Fisher Scientific；其它化学试剂都是分析纯级，试验中所用的水均为Milli-Q 超纯水。

1.2 设备与仪器

水平摇床，江苏其林贝尔仪器制造有限公司；电热鼓风干燥箱、压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；高速离心机，英国BECKMAN COULTER；超声波细胞破碎仪，南京南京先欧仪器制造有限公司；PCR 仪，德国Biometra 公司；凝胶成像仪，上海Tanon 公司；Multitemp III 恒温循环水浴器、琼脂糖凝胶电泳仪，美国GE 公司；Agilent 1260 高效液相色谱-示差折光检测器，美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大肠杆菌重组表达系统的构建 设计引物gal F2（CATGCCATGGAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC）和gal R2（CCGCTCGAGTTACGCGAAATACGGGCAGACATGG）对lacZ 基因进行PCR扩增，引入酶切位点NcoI 和XhoI。PCR 反应体系：2×GC buffer I 25 μL，dNTP （2.5 mmol/L）8 μL，gal F2 （20 μmol/L）1 μL，gal R2 （20 μmol/L）1 μL，DNA 模板1 μL，LA-Taq 0.5 μL，用ddH2O 补至50 μL。PCR 扩增条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。

用NcoI 和XhoI 同时对表达载体pET28a 和带有酶切位点β-半乳糖苷酶基因lacZ 进行双酶切，在37 ℃反应3 h。用T4DNA 连接酶将lacZ和线性化的pET28a 以一定比例混匀，在16 ℃下连接过夜，完成重组质粒pET28a-lacZ 的构建。将上述构建的重组质粒pET28a-lacZ 转入BL21（DE3）细胞中，通过卡那霉素LB 抗性平板上筛选转化子，利用菌落PCR 进行验证，PCR 反应体系和条件参考前述。

1.3.2 重组蛋白的表达及纯化 将大肠杆菌重组菌株以1%的接种量转接至100 mL 含卡那霉素的LB 培养基中，在37 ℃下培养3～4 h （OD600nm=0.6～1.0），以0.5 mmol/L 的IPTG 诱导产酶，于20 ℃下，200 r/min 培养20 h。发酵液在4 ℃下以5 000 r/min 的转速冷冻离心10 min，将菌体沉淀用pH 6.7 的PBS （钠盐）洗涤，重复2 次后，加入等体积pH 6.7 的PBS 缓冲液，冰水浴超声处理（超声1.5 s，间歇2 s）10 min，然后4 ℃、5 000 r/min 下冷冻离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.3.3 β-半乳糖苷酶水解酶活力测定 参考陈真真等[2]的测定方法，利用HPLC 外标法测定。取500 μL 0.5 mol/L 乳糖溶液 （0.1 mol/L、pH 6.7 的PBS 缓冲液配制），在50 ℃下保温10 min 后加入1 000 μL 酶液，振荡混匀继续反应4 h，沸水浴5 min 灭酶，并用0.22 μm 微孔过滤器过滤，用HPLC-示差检测器检验乳糖水解活性与低聚半乳糖的生成情况。

色谱测定条件：Agilent 1260 高效液相色谱-示差折光检测器；柱温30 ℃；色谱柱：氨基高效液相色谱柱 （Inertsil HPLC Column NH2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：V乙腈：V水=7∶3；流速1.0 mL/min。

1.3.4 低聚半乳糖的测定 取适量酶解液沸水浴5 min 灭酶，适当稀释经0.22 μm 微孔过滤器过滤。将适当浓度的样品依次上样于硅胶层析板上，将硅胶板置于在层析缸中经过二次展开并显色后，在105 ℃烘箱中烘烤至显色。展开剂配制：V正丁醇∶V乙醇∶V高纯水=5∶3∶2，显色剂：V甲醇∶V浓硫酸=20∶1。

1.3.5 酶法合成低聚半乳糖工艺优化 以优化β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖（GOS）工艺为目标，分别考察不同温度，反应时间，pH 值，底物添加量，加酶量对乳糖转化率和低聚半乳糖合成的影响。

根据单因素实验确定影响合成低聚半乳糖的主要因素，利用Design-Expert 软件进行Box-Behnken 三因素三水平试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 lacZ 基因的重组表达

带有NcoI 和XhoI 酶切位点的β-半乳糖酶基因与pET28a 连接，构成重组质粒pET28a-lacZ。将重组质粒pET28a-lacZ 通过热击导入大肠杆菌BL21（DE3）后，在37 ℃下进行培养，对长出的克隆子进行验证，结果如图1。其中M 为1 kb Marker，泳道1～10 为菌落PCR 产物。

图1 菌落PCR 电泳图Fig.1 PCR products of colony PCR

对产生的转化子进行水解酶活力测定，其中转化子pET28a-18 和pET28a-24 的水解酶活力分别为（99.067±0.12）U/mL 和（100.247±0.08）U/mL，较重组表达前的水解酶活力提高了近10 倍，因此B5582Y 产乳糖酶基因的克隆表达成功，与王元火等[17]将环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达效率相比，高出了5 倍。同时因上清液中没有酶活，可知重组蛋白以包涵体的形式存在于表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）中。

2.2 不同工艺条件对合成GOS 的影响

不同工艺条件对合成GOS 的影响见图2。由图2可知，随着温度，pH 值的增大，GOS 产量呈先增大后减小的趋势，最适温度和pH 值分别为45℃、7.0～7.5。伴随反应时间的推进，GOS 产量也逐渐增加，在10 h 趋势开始平稳；在16 h 时，因底物添加量降低，导致转糖苷作用减弱，GOS 被水解，最终GOS 产量下降，故反应时间定为10 h。初始底物添加量从0 升到90%时，GOS 产量不断增加；当超过100%时，因反应体系的传质效果变差，致使GOS 产量降低，故初始底物添加量定为90%较为适宜。加酶量的增加能提高GOS 产量，然而加酶量超过120 U/mL 时，转糖苷生成的GOS 便无法长期存在，使得GOS 产量下降，故加酶量定为120 U/mL 较为合适。

图2 不同工艺条件对合成GOS 的影响Fig.2 Effect of different process conditions on the synthesis of GOS

酶法合成GOS 的工艺中，β-半乳糖苷酶的来源不同，其合成GOS 的工艺条件也存在着差异。米曲霉（A.oryzae）来源的酶最适pH 值为4.5～6.0，温度在40～60 ℃之间[18]；环状芽胞杆菌（B.circulans）来源的最适pH 值为6.0～6.5，温度在55～60 ℃之间[19-21]；克鲁氏乳酸酵母（K.Lactis）来源的最适pH 值为6.5～7.0，温度在35～40 ℃之间[22-24]。相比而言，本文研究的β-半乳糖苷酶与克鲁氏乳酸酵母来源β-半乳糖苷酶合成GOS 条件更相近，而克鲁氏乳酸酵母的GOS 产率在35%左右，略低于本研究中的β-半乳糖苷酶。

2.3 响应面优化确定最佳因素水平

由单因素实验结果，选择关键控制因素：A（温度），B （加酶量），C （底物添加量），运用Box-Behnken 进行三因素三水平的试验设计，试验结果见表1。试验结果经Design-Expert 软件分析，低聚半乳糖（GOS）占总糖含量的百分比为响应值Y，得回归方程：

表1 Box-Behnken 试验设计及试验结果Table 1 Experimental design of Box-Behnken and corresponding results

Y=46.4+2.63A-2.00B+2.88C+4.25AB-0.5AC+2.75BC-6.7A2-5.95B2-8.2C2。

对回归方程进行方差分析，结果见表2，模型的P＞F 值为0.0047 小于0.01，表明模型极显著。在一次项中因素A（温度）和C（底物添加量）对GOS 产量的影响高于因素B（加酶量）。因此，推测因素A（温度）和C（底物添加量）对该结果影响较大。

表2 Box-Behnken 试验回归分析Table 2 Regression analysis of Box-Behnken experiment

图3为响应面分析图，由图可知各因素交互作用对响应值影响的大小。等高线反映了各变量间交互作用的情况，当等高线越接近椭圆时，说明两个因素间的交互作用越显著，故从图中也可知A、B、C 3 个因素间的交互作用显著。

图3 酶解温度、加酶量和初始乳糖添加量对GOS 产量的影响Fig.3 The response surface curve of the combined effect of temperature、initial lactose concentration and enzyme concentration on yield of GOS

2.4 验证试验

根据Design-Expert 软件分析，得到当A=44℃，B=130 U/mL，C=95%时，模拟回归方程取最大值为46.9%，即加酶量130 U/mL，温度为44 ℃，底物添加量为95%。考虑到90%时乳糖已经处于饱和状态，故选取90%的乳糖作为最终底物添加量。在以上试验条件下进行3 次重复试验，结果分别为41%，45%，46%，平均值44%，实际测验值与预测值接近，说明可以准确地反映各变量因子对低聚半乳糖合成情况的影响。由于低聚半乳糖的生产与初始底物量、加酶量均有很大关系，因此在生产低聚半乳糖时应注意乳糖的及时补充，以保证可以有较多的低聚半乳糖的产生。

Nguyen 等[25]报道保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）产β-半乳糖苷酶合成GOS 得率为50%；Frenzel 等[26]发现环状芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶合成GOS 得率为41%；Vera 等[27]研究的米曲霉来源的β-半乳糖苷酶合成GOS 得率不足30%；而Katrolia 等[28]报道的铜绿拟青霉（Paecilomyces aerugineus）来源的β-半乳糖糖苷酶在毕赤酵母中表达的重组酶合成GOS 的产率仅19.7%。相比而言，本研究中密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganens）来源的β-半乳糖苷酶经重组后依然具有较好的转糖苷活性。在最优条件下酶法转化乳糖产物通过TLC 薄层层析分析，结果如图4所示。由图可知，该重组酶在水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖时，还生成了不同丰度的低聚糖。研究表明，常见的GOS 主要由β（1-4）糖苷键连接而成，而GH2 家族的β-半乳糖苷酶主要合成β（1-3）和β（1-6）糖苷键[11]，本研究所用的β-半乳糖苷酶即为GH2 家族酶，据此可推测该重组酶作用生成的产物中有较大比例的β（1-3）和β（1-6）糖苷键连接而成GOS，有别于一般的GOS 中的低聚糖组分，具有较好的研究价值。

图4 以乳糖为底物时水解产物的薄层层析图Fig.4 TLC of hydrolysate with lactose as substrate

3 结论

团队前期研究发现的克雷伯氏菌B5582Y，所产的β-半乳糖苷酶具有较好的转糖苷活性，丰富了β-半乳糖苷酶的天然来源。本研究中，经重组表达后的β-半乳糖苷酶酶活力比野生菌株提高约10 倍，且转糖苷活性保持在较高水平。酶法转化乳糖过程中，最优条件下可使GOS 得率达到44%，与已报道的β-半乳糖苷酶相比具有良好的转糖苷作用。该研究结果表明克雷伯氏菌B5582Y来源的β-半乳糖苷酶及其重组酶在低聚半乳糖合成中具有较大的应用潜力。