西瓜种质资源背景选择标记筛选及遗传多样性分析

栾非时，闫令文，刘树森，刘钊，高鹏，宋正峰，朱子成，刘宏宇

（1.农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030；3.山东省寿光市三木种苗有限公司，山东寿光 262704；4.潍坊科技学院农学与环境学院，山东寿光 262799）

西瓜是我国重要水果型蔬菜之一，在园艺作物生产中具有重要地位[1]。西瓜种质资源是新品种选育物质基础，西瓜种质遗传背景狭窄一直是限制我国西瓜育种发展重要因素[2]。传统育种手段周期长、见效慢、连锁累赘难以消除，利用分子标记辅助背景选择，可加快遗传背景恢复速度，缩短育种周期[3-4]。在分子水平上研究西瓜种质资源亲缘关系，将极大降低遗传背景相似的组合，提高育种科学性与可行性，因此筛选一套用于西瓜背景选择的分子标记，研究西瓜种质资源遗传多样性，将为今后西瓜育种提供理论基础。

背景选择对象范围广，几乎遍布作物基因组。因此在开展背景选择时，应尽可能选用均匀分布在染色体上的分子标记[5]。简单重复序列（Sim⁃ple sequence repeat，SSR）标记技术具有多态性高、操作简单、对DNA质量要求低等优势[6]，广泛应用于园艺作物背景选择、遗传多样性分析、DNA指纹图谱、品种鉴定等研究[7-8]。王振选用331对SSR引物对玉米两亲本开展扩增，筛选出多态性较高的SSR引物60对作背景选择，BC2F1群体背景回复率平均值为87.36%[5]。张兆辉等筛选出21对SSR引物，扩增82份瓠瓜种质资源，将其分为三大类群[9]。段红梅利用198对SSR引物，筛选出均匀覆盖在大豆全基因组上的51对SSR引物研究背景选择效果，结果表明20对引物与51对引物背景选择效果相似[10]。刘基生等选用200对SSR引物，对101份甘蓝材料作标记，筛选得到36对多态性较高引物，最终将供试材料分为8个类群，并选出23份具有代表性自交系材料[11]。董冬利用覆盖小麦全基因组114对SSR引物，筛选出多态性较高SSR引物46对用于遗传背景回复率分析，BC1F2个体遗传回复率平均为76.2%[12]。武向斌在美洲南瓜全基因组上开发38 104个SSR标记，利用66对SSR引物，将61份南瓜种质材料聚为野生种和栽培种两大类[13]。张慕月利用23对SSR引物，分析276份西瓜种质材料遗传多样性，将供试材料聚为5个类群[14]。史建磊等选用37对SSR引物对48份黄瓜材料扩增，将这些材料聚为4类[15]。

本研究在446对SSR引物中筛选出在西瓜11条染色体上分布相对均匀、多态性较高的110对SSR引物，建立一套用于西瓜背景选择的分子标记，结合聚类分析、群体结构分析、全基因组关联分析等方法，研究81份西瓜种质材料遗传多样性，为筛选培育西瓜新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验81份西瓜种质材料由东北农业大学园艺园林学院西甜瓜分子遗传育种团队保存。按照西瓜属分类方法，将81份西瓜种质材料分为5类变种，西瓜种（C.lanatus）69份，毛西瓜变种（C.lanatus var.lanatus）8份，饲用西瓜变种（C.colo⁃cynthis var.citroides）1份，药西瓜种（C.colocynthis）2份，热迷西瓜种（C.rehmii）1份，81份西瓜种质材料信息（见表1）。

表1 81份西瓜种质资源信息Table 1 Information on 81 watermelon germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 田间试验方法

①植株管理

试验材料于2019年3月下旬种植于黑龙江省哈尔滨市东北农业大学向阳实验实习与示范基地5号大棚。采取随机区组试验设计，每份材料种植5株，株行距80 cm×50 cm，每个小区间种植京颖作为保护行。取81份西瓜种质材料种子，每份10粒，纱布包裹，标明材料名称。温汤浸种12 h，32℃恒温箱中催芽，待80%种子露白后，使用营养钵育苗，播种于东北农业大学设施园艺工程中心1号温室。5月上旬定植于东北农业大学向阳实验实习与示范基地大棚内，采用吊蔓栽培，双蔓整枝，人工授粉，为避免营养竞争，每株仅留1个瓜，正常田间管理，授粉45 d后收获西瓜果实，并测定性状指标。

②果实性状调查

本研究调查81份西瓜种质材料9种农艺性状，包括果实重量、果实长度、果实宽度、果皮厚度、中心果肉可溶性固形物含量、果肉可溶性固形物含量、种子长度、种子宽度、种子厚度。具体方法参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》[16]。

1.2.2 分子试验方法

①DNA提取

在幼苗期采集幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取西瓜供试样品DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，100µL ddH2O溶解，-20℃保存备用。

②SSR引物合成和PCR扩增

本试验446对SSR引物由北京市农林科学院许勇研究员团队提供，由上海生工生物工程公司合成。

PCR反应10µL体系：DNA模板（30 mg·L-1）1µL，上游引物（10µmol·L-1）0.5µL，下游引物（10µmol·L-1）0.5µL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）1.0µL，dNTP（25 mmol·L-1）0.15µL，TaqDNA聚合酶（5 U·µL-1）0.1µL，ddH2O 6.75µL。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

退火温度确定：根据设计的退火温度作筛选，若结果伪带、杂带较多可适当提高退火温度，若条带较淡或空白可适当降低退火温度。

③电泳

PCR产物中加入2.5µL10×Loading Buffer，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，恒压200 V，电泳2 h，使用银染法染色并拍照记录数据。

1.3 数据处理与统计分析

读取扩增后清晰条带，在相同迁移位置，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“-”，不同引物扩增结果构成原始的“0，1”二元数据矩阵。将田间已测定果实性状输入Microsoft Excel 2019软件，并计算各性状平均值、标准差。频率分布在SPSS 22软件中完成。运用Popgen 32软件计算遗传多样性参数，利用PIC-CALCVer-sion 0.6软件计算多态性信息含量（PIC）值，利用软件NTSYS-pc 2.10，采用非加权组平均法（UPGMA），对供试材料作聚类分析。利用TASSEL 5.0软件中GLM一般线性模型将81份西瓜种质资源表型数据和基因型数据结合后，开展全基因组关联分析。

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2 结果与分析

2.1 西瓜农艺性状表型分析

频率分布直方图见图1。结果表明，果实重量频率变化为1.00~13.80 kg，果实长度频率变化为12.00~35.00 cm，果实宽度频率变化为10.60~32.30 cm，果皮厚度频率变化为0.30~4.00 cm，中心果肉可溶性固形物含量频率变化为2.00~12.50，近皮果肉可溶性固形物含量频率变化为1.60~11.60，种子长度频率变化为7.74~12.51 mm，种子宽度频率变化为4.37~10.52 mm，种子厚度频率变化为1.54~3.89 mm，9个表型性状符合正态分布。变异系数主要反映某一性状数值，9个表型性状变异情况见表2，果实重量和果皮厚度变异系数最大，均为48%，果实宽度变异系数最小，为17%。按变异系数可将西瓜9个表型性状变异程度分为小（CV≤25%）、中（25%

表2 西瓜9个农艺性状表型分析Table 2 Phenotypic analysis of nine agronomic traits in watermelon

图1 9个西瓜表型性状频次直方图Fig.1 Histogram for the nine watermelon phenotypic traits

2.2 SSR引物筛选及多态性分析

运用446对SSR引物对16份具有代表性西瓜种质材料作扩增，筛选出110对带型清晰、多态性高SSR引物，覆盖西瓜11条染色体，每条染色体均分布10对引物，占总引物数24.7%。再用110对SSR引物对81份种质材料作基因分型。经PCR扩增后DNA片段长度为100~330 bp，共计得到清晰可辨认条带8 250条，这些引物对所有种质材料扩增结果多态性丰富、条带清晰且特异性高。110对引物多态性分析结果见表3。

表3 110对SSR引物多态性信息Table 3 Polymorphism of 110 pairs of SSR primers

在81份西瓜种质材料中共检测到335个等位基因，等位基因数变化为2~8个，平均为3.4个。其中BVWS00209等位基因数最多（8个）。有效等位基因数变化为1.17~5.53，平均为1.97。（PIC）值变化为0.25~0.80，平均为0.40，其中，BVWS00209多态性最高，为0.80。观测杂合度变幅为0.32~1.00，平均为0.93。Shannon信息指数变幅变化为0.28~1.58，平均为0.76。综合数据指标表明110对SSR引物多态性良好，有效揭示81份西瓜种质材料遗传多样性。

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2.3 聚类分析

利用NTSYS-pc2.10软件，以遗传相似系数采用UPGMA方法聚类（见图2）。结果表明，在遗传相似系数为0.68时，81份西瓜种质材料可分为两大类群。第一类群包括69份西瓜种质材料，均为西瓜种（C.lanatus）。第二类群共12份西瓜种质材料，包括8份毛西瓜变种（C.lanatus var.lanatus）、2份药西瓜种（C.colocynthis）、1份饲用西瓜变种（C.lanatus var.citroides）、1份热迷西瓜种（C.rehmii），因此根据进化树节点位置细分，又可将第二类群分为3个亚群，第一亚群将热迷西瓜种Grif16135单独聚为一类，第二亚群将2份药西瓜种PI532738和PI179881聚为一类，第三亚群将8份毛西瓜变种PI296341、PI500308、PI482362、绿子砧木西瓜、PI271775、PI 459074、PI482255、PI508443和1份饲用西瓜变种PI482322-1聚为一类。

图2 81份西瓜种质资源聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 81 watermelon germplasm resources

2.4 全基因组关联分析

利用Tassel 5.0软件中GLM一般线性模型，将110对SSR标记与81份西瓜种质资源9个表型性状作全基因组关联分析，共检测到与西瓜种质资源9个表型性状关联SSR标记109个，根据Bonferroni检验，P0.05=0.05/335=0.00014925，P0.01=0.01/335=0.00002985，分别取负对数为3.826和4.525，将p≤10-5（-LogP≥3.826）作为关联分析中标记与性状之间显著关联阈值，全基因组关联分析结果见表4。所检测到109个SSR标记中，有5个标记与3个农艺性状显著关联，BVWS00589、BVWS00209与果皮厚度相关，分别位于4号和9号染色体（见图3）。BVWS00544、BVWS02384与中心果肉可溶性固形物含量相关，分别位于11号和6号染色体（见图4）。BVWS00807与种子厚度相关，位于4号染色体（见图5）。

图3 果实厚度曼哈顿图Fig.3 Manhattan plot of fruit thickness

图4 中心果肉可溶固形物含量曼哈顿图Fig.4 Manhattan plot of soluble solids content in central pulp

图5 种子厚度曼哈顿图Fig.5 Manhattan plot of seed thickness

表4 西瓜3个性状显著关联SSR标记Table 4 SSR markers of three traits in watermelon were significantly associated

3 讨论与结论

3.1 背景选择标记筛选

分子标记辅助背景选择关键是获得在基因组上分布相对均匀且数量充足的分子标记，由于随背景选择标记数增加，在准确度增加同时试验成本也大幅增加，因此，针对特定植物材料和选择时期，需确定适宜数量的背景选择标记[11]。Hospi⁃tal等研究表明全基因组背景选择需适宜标记数为每100 cM 2~3个标记，在此基础上增加标记数，效果并不显著[17]。刘基生等在甘蓝背景选择中使用标记密度为平均每条染色体9.8个[11]。夏军红等在玉米背景选择中使用标记密度为平均每条染色体7.1个[18]。本研究在西瓜11条染色体上均分布10个标记，标记数量较为适宜，可用于西瓜背景选择工作。

3.2 西瓜种质资源遗传多样性分析

SSR标记因其自身优点，广泛适用于种质材料遗传多样性分析[19]。Wang等通过SSR标记分析61份西瓜材料遗传多样性，结果表明引物多态性在供试种质资源间差异较大且栽培品种多态性普遍较低[20]。石磊等用31对SSR引物分析50份西瓜种质资源遗传多样性，等位基因数平均为1.46个，Shannon多样性信息指数平均为0.73[21]。徐彦刚等利用45对SSR引物分析78份西瓜种质材料遗传多样性，平均等位基因数1.98，平均PIC值0.41[22]。本研究遗传多样性分析结果高于易丽聪等得到的平均香浓信息指数0.43和平均PIC值0.23[23]。低于王准等得到的平均等位基因数6.05个和平均PIC值0.49[24]，高于赵胜杰等得到的平均PIC值0.31[25]。本研究在西瓜全基因组开发的446对SSR引物中筛选出110对引物，多态性信息含量（PIC）变化为0.25~0.80，平均0.40，筛选的SSR引物多态性较高，但与前人开发的西瓜23对核心引物对比，部分引物多态性较低，可能因选取的供试材料以西瓜种居多，且大多数为栽培种，仅少数为野生种，说明SSR引物多态性不仅受引物特性限制，还可能与群体大小、种类、标记数量有关。虽然西瓜已筛选出23对核心引物并有效用于西瓜种质资源遗传多样性分析，但背景选择需在每条染色体上分布充足且相对均匀的标记才可开展，所以本研究在全基因组开发标记中，初步建立一套分布广且多态性高标记作为西瓜背景选择标记。

3.3 遗传多样性分析

程莉莉等利用26对SSR引物对383份玉米种质材料作聚类分析，将供试材料分为6大类[26]。本研究聚类分析结果表明，81份西瓜种质被分为两大类群，大部分西瓜种质材料被划分到第一类群中，均为西瓜种，说明西瓜种间亲缘关系较近。药西瓜种与热迷西瓜种、毛西瓜变种、饲用西瓜变种被划分到第二类群中，说明其亲缘关系较近，且两群体亲缘关系明显较远。通过聚类分析表明，供试材料在分子水平分类结果与西瓜属分类存在一定相关性。同时，猜测这两大类群亲缘关系较远的原因可能是第一类群中西瓜材料多为栽培种，第二类群西瓜材料多为野生种所致。

3.4 全基因组关联分析

本研究检测到与果皮厚度显著关联标记2个，分别位于4号和9号染色体，检测到与中心果肉可溶性固形物含量显著关联标记2个，分别位于6号和11号染色体，检测到与种子厚度显著关联标记1个，位于4号染色体上，与郭禄芹对西瓜全基因组作关联分析结果一致[27]。程瑶利用花园母本和LSW-177构建重组自交系作QTL分析，共检测到控制可溶性糖含量5个QTL，分布在2号、6号、7号和9号连锁群上[28]；周慧文等利用PI186490和LSW-177构建F2群体，对种子大小作QTL分析，检测到与种子厚度相关QTL 2个，分别位于3号和6号连锁群[29]。比较发现，通过QTL定位到的QTL位点与本研究关联分析检测到标记结果存在差异，原因可能是环境条件不同，如生长时期浇水量、光照、温度等变化影响西瓜糖含量形成和植物各器官发育，表型测定准确性也对关联结果产生重要影响。另一方面，可能与试验群体有关，多数研究者选择F2或重组自交系，而本试验选用自然群体，自然群体中个体间亲缘关系或亚群结构影响均可能造成关联分析结果的差异。