不同烟草品种幼苗对干旱胁迫的生物学响应

洪以群，胡海军，吴亚男，景柠檬，王 丽,申 林

(遵义师范学院，贵州 遵义 563006)

1 引言

烟草(NicotianatabacumL.)，茄科烟草属植物，是中国重要的经济作物之一。贵州省是我国烟草生产的第二大基地，其年产量约占全国比重的12%～15%[1]。干旱是由于长期无雨或少雨，使得土壤相对含水量降低，作物水分平衡遭到破坏而减产的农业气象灾害。干旱是我国农业生产面临的严重问题之一。近年来，大面积周期性降雨量分布严重失衡，以及用水不当等均使干旱的程度进一步加剧。干旱条件下，导致农业损失超过其它逆境所造成损失的总和[2]。

干旱胁迫是指当植物根系的吸水量小于植物体内生理代谢活动的耗水量时，植物细胞出现水分亏缺，细胞发生质壁分离，使得植株的生长发育和生理代谢受到影响的现象。干旱胁迫对植物的危害主要体现在：细胞活性、器官和组织功能受损，植物体活性氧增加，细胞渗透调节物质发生变化，最终使得植物个体或植物群体的生长受到抑制，形态发生变化，生物量和产量都受到了极其严重的负面影响[3]。陈贵等[4]研究表明，丙二醛是烟草受到干旱胁迫时发生过氧化反应的最终产物之一，对于烟草叶片具有较大的细胞毒性，能够引起烟草植株细胞功能上的紊乱，并且会对细胞中的核酸、蛋白质、酶等造成一定程度的破坏；丙二醛含量高低能够反映出烟草幼苗受到干旱胁迫时细胞质膜受破坏程度的大小，烟草细胞膜脂发生过氧化作用的强弱。朱凤荣等[5]研究认为，丙二醛较高的烟草品种，其抗旱性相对较弱。罗占春等[6]研究结果表明，在干旱胁迫的条件下，烟草植株体内的活性氧物质不断升高，且不同品种烟草植株间的变化趋势相似，但不同品种烟草幼苗体内的活性氧物质的变化幅度有所不同。在干旱胁迫的条件下，烟草在抵御氧化胁迫的整个防御系统中，超氧化物歧化酶是烟草体内第一个清除活性氧的关键酶。覃鹏等[7]研究结果表明，超氧化物歧化酶相对活性越高，干旱胁迫对烟草完成正常生理活动的影响越小，该烟草的抗旱性越好。过氧化氢酶主要存在于植物微体中，与过氧化物酶同是H2O2的解毒剂，能够有效控制植物细胞内活性氧的积累[8]。此外，过氧化氢酶还与生长素、NADH、DADPH等的氧化作用有关，在植物的代谢过程中起着非常重要的作用，其活性的高低与植物的代谢强度以及抗性有着极其密切的关系。由佳辉等[9]研究结果表明，相对电导率是用来衡量植物抗逆性的一个重要指标；相对电导率越高，细胞膜的透性越差，干旱胁迫对烟草细胞膜的伤害越严重，即植物受到的伤害程度越大，其抗旱性能越差。杨伟强等[10～12]研究认为，不同烟草品种幼苗在同等干旱胁迫的环境中，可溶性糖含量越高，细胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗性越高。综上所述，在干旱胁迫的条件下，不同烟草品种对干旱胁迫的生物学响应各有不同，但可在一定程度上反映出不同品种的抗逆性。

本试验以亚布力旱烟和云烟87为试验材料，通过对其丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、相对电导率、过氧化氢酶活性、可溶性糖含量等生理指标进行测定，进一步明确不同烟草品种幼苗对干旱胁迫的生物学响应，以减轻贵州地区因干旱胁迫造成烟草产量和品质的降低，充分发挥该地区烟草种植的生产潜力，实现干旱胁迫下农业可持续发展以及大力保障烟草作物经济安全，为筛选抗旱性能较强的品种提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

烤烟品种：云烟87，由云南省烟草科学研究所提供；亚布力旱烟，由黑龙江省哈尔滨市尚志市提供。

2.2 主要的试验药品

0.1 mol/L pH 7.8磷酸缓冲液、蛋氨酸、750 μmol/LNBT、EDTA、20 μmol/L核黄素、石英砂、标准葡萄糖溶液(100 μg/mL)、蒽酮试剂、丙酮、无水乙醇、5%三氯乙酸溶液、0.5%硫代巴比妥溶液、高锰酸钾、草酸等。

2.3 主要仪器

FA1004型电子分析天平、SHP-150A数显生化培养箱、HH-8双列八孔恒温水浴锅、UV752N紫外分光光度计、DGG-9076A烘箱、TZS-1K-G型号水分测定仪。

2.4 试验设计与处理

盆栽试验于2019年7～12月在遵义师范学院实验基地进行。每盆装土10 kg，施复合肥20 g。每个品种种植12盆。烟草幼苗移栽后，正常浇水，待烟草幼苗生长至对水分敏感期，开始控制浇水。处理前10 d，使土壤中的含水量占田间最大持水量的50%，使烟草幼苗处于中等干旱程度的胁迫；处理10～20 d，土壤中的含水量占田间最大持水量的30%，使烟草幼苗处于重度干旱胁迫；处理25 d后，对丙二醛、过氧化氢酶活性，相对电导率等相关指标进行测定。其他管理措施同大田。

2.5 试验指标的测定

2.5.1 丙二醛含量的测定

硫代巴比妥酸法[13]。取0.5 g叶片加1.0 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL试管，转移至离心管，并在转速为13000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，取其上清液即为酶提取液。吸1.5 mL酶提取液于刻度试管中，加2.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸、5%三氯乙酸溶液，沸水浴10～15 min，迅速冷却，转移至离心管，于转速为1800 r/min的离心机中离心10 min，取其上清液于532 nm、600 nm测定其吸光值。以蒸馏水调零。

结果计算：

MDA含量(μmoL/g)=

(1)

式(1)中：A:反应液总浓度(mL);V:提取液总量(mL);a:测定用提取液量(mL);W:材料重(g); 1.55×10-1:丙二醛微摩不消光系数。

2.5.2 超氧化物歧化酶活性

邻苯三酚自氧化法[14]。取0.5 g叶片加1 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL试管，转移至离心管，并在转速为13000 r/min 4 ℃条件下离心20 min，取其上清液即为酶提取液(表1)。

表1 超氧化物歧化酶活性反应体系

结果计算：

(2)

式(2)中：A0：照光对照管的光吸收值(Abs);AS：样品管的光吸收值(Abs);VT：样液总体积(mL);V1：测定时样品用量(mL);FW：样品鲜重(g)。

2.5.3 可溶性糖含量的测定

蒽酮硫酸法[15]。剪切新鲜烟草叶片样品0.5 g，放入50 mL的三角瓶中，再加25 mL蒸馏水，沸水浴20 min，冷却，过滤入100 mL容量瓶中，用热水冲洗残渣数次，定容至刻度。取样品提取液0.5 mL加蒸馏水0.5 mL，再加蒽酮试剂5.0 mL于试管中摇匀，于620 nm处测定可溶性糖的吸光值。结果计算：

(3)

(4)

2.5.4 相对电导率测定

电导率法[16]。取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性，少含茎节)，用自来水洗干净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.1 g，分别置于10 mL去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞，用ORIONTDS型电导仪测定叶片电导率。

结果计算：

(5)

式(6)中：R1：室温下浸泡处理12 h后，浸提液电导率;R2：水浴锅沸水浴30 min后，冷却至室温浸提液电导率。

2.5.5 过氧化氢酶的测定

高锰酸钾滴定法[17]。 酶液提取:称取剪碎混匀的新鲜烟草叶片1.0 g,置于研钵中，加0.2 g CaCO3和蒸馏水2.0 mL，仔细研磨成匀浆，移入100 mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度，振荡片刻，静止，取上清液10.0 mL移入100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。酶活性测定: 取100 mL三角瓶6个,编号。向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0 mL，立即向4号、5号、6号瓶中各加入3.6 mol/L H2SO4，5.0 mL以终止酶反应，作为空白测定。然后将各瓶放在20 ℃水浴中保温。待瓶内温度达到20 ℃时，向各瓶准确加入5.0 mL 0.1 mol/L H2O2摇匀，记录时间。5 min后再依次向1号、2号、3号瓶各加入3.6 mol/L H2SO45.0 mL终止酶反应。然后向每瓶各加20%的KI 1.0 mL，3滴钼酸铵及5滴淀粉指示剂。用0.02 mol/L Na2S2O3滴定至蓝色消失。

结果计算：

(6)

式(6)中：A：滴定值(mL);B：样品滴定值(mL);C：Na2S2O3浓度(mmol/L);a：测定时酶液用量(mL);V：酶液总体积(mL);W：样品重(g);t：反应时间(min); 17：1/2H2O2的毫摩尔质量(mg)。 注意:所用K2MnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

2.6 数据处理

利用Excel 2016对试验前期数据进行进行整理与分析，利用SPSS24.0对数据进行统计与分析，使用Origin8.5进行作图。

3 结果与分析

3.1 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛含量的高低可以间接反映出烟草植株膜系统受害程度，以及烟草植株的抗逆性强弱。从图1可以看出，亚布力旱烟的丙二醛含量为65.43 μmol/g，云烟87的丙二醛含量是45.47 μmol/g，亚布力旱烟的丙二醛含量较云烟87高43.90% μmol/g，差异达显著水平。这说明，在干旱胁迫的条件下，亚布力旱烟细胞质膜受到破坏的程度明显高于云烟87，受干旱胁迫的危害程度较重。

图1 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗丙二醛含量的影响

3.2 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗细胞膜透性的影响

相对电导率越高，干旱胁迫对烟草幼苗叶片细胞膜的伤害越严重，其抗旱性越差。由图2可知，亚布力旱烟和云烟87在连续干旱胁迫的条件下，亚布力旱烟和云烟87的相对电导率分别为0.42 μs/cm和0.19 μs/cm，亚布力旱烟较云烟87高121.05%，差异达显著水平。由此可以看出，云烟87较亚布力旱烟具有更强的抗旱能力。

图2 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗细胞膜透性的影响

3.3 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

在干旱胁迫的逆境中，烟草可通过抗氧化酶系统对烟草体内的活性氧进行清除，为烟草完成正常的生理活动代谢提供了一定的保障。从图3可以看出，在干旱胁迫的条件下，云烟87的SOD活性明显高于亚布力旱烟；其中，亚布力旱烟和云烟87的SOD活性分别为5.89 μ/g、13.13 μ/g，亚布力旱烟较云烟87的SOD活性降低了55.14%，差异达显著水平。由此可知，在干旱胁迫的条件下，云烟87的SOD活性所作出的生理响应更为显著，从而提高了云烟87的抗旱性。

图3 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

3.4 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶活性的高低与植物的代谢强度及其抗性有着密切的关系。由图4可以看出，亚布力旱烟幼苗体内的CAT酶活性为1.52 μmol/(g·min)，云烟87的过氧化氢酶活性为3.21 μmol/(g·min)，亚布力旱烟较云烟87低了52.65%，两者差异达显著水平。这说明，在干旱胁迫条件下，云烟87过氧化氢酶的活性明显高于亚布力旱烟，其能更好地清除过氧化氢对植物体本身造成的伤害，从而表现出更强的抗旱性。

图4 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗过氧化氢酶活性的影响

3.5 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗可溶性糖含量的影响

在逆境中，植物的可溶性糖含量越高，细胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗逆性越强。由图5可以看出，在干旱胁迫的条件下，云烟87的可溶性糖含量明显高于亚布力旱烟，其值分别为125.99 μg/mL、77.90 μg/mL，亚布力旱烟较云烟87低了38.17%。由此可知，与亚布力旱烟相比，受干旱胁迫的云烟87对可溶性糖含量具有较强的调控能力，从而降低了干旱胁迫的危害，这与SOD酶活性和CAT酶活性的变化规律相一致。

图5 干旱胁迫对不同烟草品种幼苗可溶性糖含量的影响

4 结论与讨论

中国大部分烟区多位于干旱、半干旱环境中。由于缺乏必要的灌溉条件，每年总有部分地区烤烟受旱灾危害严重。陆德彪等[18]研究表明，干旱胁迫条件下，相对电导率、丙二醛含量及抗氧化酶活性等均能够很好地表征植物抗旱性的强弱。本试验结果表明，在干旱胁迫的条件下，亚布力旱烟的相对电导率、丙二醛含量相对较高，这可能是由于干旱胁迫使亚布力旱烟细胞膜受害较为严重，渗透势增强，受害程度较重，表现出对干旱胁迫较弱的适应性。

在逆境条件下，过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等是植株体内清除活性氧的重要保护酶。陆德彪等[18]研究表明，在逆境条件下，抗旱性较强的品种通过快速提高酶的活性，及时清除细胞中的过氧化氢、超氧阴离子自由基等有害物质，以避免其对细胞造成的过度损伤。在干旱胁迫条件下，云烟87的CAT酶活性、SOD酶活性均明显地高于亚布力旱烟，这说明云烟87较亚布力旱烟更能够有效地清除烟草体内的活性氧物质对植物体本身造成的伤害，从而表现出较强的抗旱性。此外，在干旱胁迫的条件下，植物体可以通过提高可溶性糖的含量来提高细胞液的浓度，降低其渗透势，保持其体内的水分，维持正常的生理代谢活动。本试验研究结果表明，在干旱胁迫的条件下，云烟87的可溶性糖含量明显高于亚布力旱烟，这与SOD酶活性和CAT酶活性的变化相一致，说明云烟87较亚布力旱烟具有更强的自我调节能力，以减缓干旱胁迫造成的危害，对干旱胁迫表现出更强的抗耐性。