急性胰腺炎患者外周血miRNA⁃16和miRNA⁃192表达及其与病情严重程度的相关性

刘兴涛 王天舒 覃海森 曹举潮 黄帅

急性胰腺炎（AP）是急诊科常见严重急腹症之一，其患病率呈不断上升趋势［1］。AP 临床表现不一、病情程度不同、预后差异较大，尤其重症AP（SAP）病死率高，严重威胁患者生命安全和生存质量［2，3］。因此，对AP 采取及时有效的预判和诊治极为重要。miRNA是具有功能性、内源性的一种非编码RNA，广泛参与炎性反应、肿瘤形成、代谢及发育等多种病理生理过程［4］。随着研究深入，miRNA与AP 关系越来越受到关注［5］。本研究探讨AP 患者外周血miRNA⁃16和miRNA⁃192表达及与病情严重度的相关性，以期为诊断和治疗AP 提供参考。现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 （1）纳入标准：①符合AP 诊断标准［6］；②发病24 h 内入院者；③临床资料完整；④签订知情同意书。（2）排除标准：①慢性炎症性疾病，恶性肿瘤者；②心肝肾功能严重异常者；③精神疾病者。选取2019 年1 月至2021 年1 月在广东省第二人民医院诊治且符合研究要求的91 例AP 患者为研究对象，其中男52 例，女39 例；年龄25-72 岁，平均（58.3±7.9）岁；体质指数18-27 kg∕m2，平均（22.3±1.9）kg∕m2；按照Balthazar CT严重指数（CTSI）评估患者病情严重程度，6 分以下为轻中度组（n=57），7-10 分为重度组（n=34）。另选择同期健康体检者50 例为对照组，男26 例，女24 例；年龄24-75 岁，平均（59.4±6.5）岁；体质指数18-26 kg∕m2，平均（22.5±1.9）kg∕m2。三组一般资料无统计学差异（P>0.05），资料具有可比性。

1.2 外周血miRNA⁃16 和miRNA⁃192 检测 （1）miRNA 提取、纯化和定量分析：采集受试者外周静脉血5 ml，转速15 000 r∕min，离心10 min，收集血清样本，置于-70℃冰箱保存待测。（2）实时荧光定量PCR 法（qRT⁃PCR）测定血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192 表达：取上述采集血清，血清总RNA采用TRIzol 试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）提取，取5 μl 总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳并检测其纯度和完整度。依据逆转录试剂盒（美国Biomiga 公司）说明书逆转录为cDNA，以GAPDH作为内参基因，检测血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192表达。取cDNA 进行qRT⁃PCR，反应条件：95℃预变性10 min，95℃15 s、60℃1 min，共完成40 个循环，每个样品设置3 个复孔。采用2⁃△△Ct法计算血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192 相对表达量。引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成引物。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件包处理数据。计数资料行χ2检验，例数∕率表示；计量资料行t检验，（）表示。采用ROC 曲线分析miRNA⁃16、miRNA⁃192 对AP 诊断价值；采用 Pearson 分 析 miRNA ⁃ 16、miRNA ⁃ 192 与APACHEⅡ评分相关性。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组一般资料比较 见表2。

2.2 三组APACHEⅡ评分、血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192 相对表达量比较 见表3。

表3 三组APACHEⅡ评分、血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192 相对表达量比较（±s）

表3 三组APACHEⅡ评分、血清miRNA⁃16 和miRNA⁃192 相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻中度组比较，#P<0.05。

组别轻中度组重度组对照组例数（例）57 34 50 APACHE Ⅱ评分（分）12.98±2.53*21.24±3.56*#3.42±0.67 miRNA⁃16 1.21±0.27*1.95±0.23*#0.54±0.13 miRNA⁃192 1.86±0.38*2.93±0.56*#0.87±0.25

2.3 ROC 曲线分析miRNA⁃16 和miRNA⁃192 诊断AP 价值 见图1，表4。

图1 ROC 曲线分析miRNA⁃16 和miRNA⁃192 诊断AP 价值

表4 ROC 曲线分析miRNA⁃16 和miRNA⁃192 诊断价值

AUC 是ROC 曲线下面积，截断值经ROC 曲线法确定。

2.4 miRNA⁃16、miRNA⁃192 与APACHEⅡ评分相关性miRNA⁃16 与APACHEⅡ评分呈线性正相关（r=0.728，P=0.012）；miRNA⁃192 与APACHEⅡ评分也呈线性正相关（r=0.795，P<0.05）。

3 讨 论

AP 特征主要为局部炎症反应，具有起病急、进展快，临床表现多样，病情复杂等特点，死亡率较高［7］。目前临床AP 诊治虽取得较大进展，但其病死率仍高达10%-40%，尤其是重症患者，在发病早期若因诊断不明而贻误最佳治疗时机，则会使病死率增加20%-50%。因此，早期预测病情严重程度关系到AP 的治疗方法和预后［8］。目前监测AP 病情的实验室指标主要包括C 反应蛋白、血沉、降钙素原等，但它们在反映病情上具有一定程度的滞后，且特异度和敏感度欠佳［9］。

miRNA 一般指由长度22 个核苷酸左右的、内源基因编码的一种非编码单链RNA 分子，作为诊断和预测药物反应及生物标志物的预测因子［10］，其具有高度保守性和同源性，且表现出组织的特异性表达。既往研究表明，miRNA 在AP的发生、发展及预后中具有重要作用，包括参与细胞自噬的调节、腺泡细胞内的内质网稳态及维持腺泡细胞凋亡和坏死的平衡，miRNA 表达异常可以作为AP 评估和诊断预后的工具［9，11］。目前，AP 仍缺乏特异性的治疗方式。随着生物技术和测序的不断进步，通过干预和调控miR⁃NA 在机体内的功能或可成为AP 治疗的新契机。但目前对miRNA 应用尚处于研究阶段，许多miRNA 的潜在作用还没有被证实和发现。本研究结果显示，轻中度组和重度组血清miRNA⁃16和miRNA⁃192 相对表达量明显高于对照组，重度组明显高于轻中度组，显示AP 患者血清miRNA⁃16和miRNA⁃192 存在高表达。另外，从ROC 曲线分析发现，miRNA⁃16 和miRNA⁃192 诊断AP 的灵敏度分别为67.27%和72.22%，而特异度分别为63.89%和72.97%，提示其在诊断AP 中具有良好灵敏度和特异度；且miRNA⁃16 和miRNA⁃192 与APACHEⅡ评分均呈明显线性正相关，且随着病情加重而增高。因此，我们推测其与AP 程度呈明显正相关，在将来可能作为评估AP 严重程度和治疗有效性的潜在生物指标。

综 上 所 述，AP 患 者 外 周 血miRNA⁃16 和miRNA⁃192 呈高表达，且与病情程度呈明显线性正相关，有望成为研判急性胰腺炎的重要诊断和预后指标。