地西他滨对急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响

刘利 曹培杰 袁玉 王彩霞

AML 是一种在细胞遗传学和分子生物学存在 高度异质性的血液恶性肿瘤。它是成人白血病中最常见的类型，已经成为严重危害成人健康的重大疾病之一［1］。AML 的病理基础是由体细胞突变，细胞遗传学异常，表观遗传学改变和转录改变等一系列因素引起的细胞增殖、分化及凋亡的改变。地西他滨是一种表观遗传学抑制剂，主要是通过磷酸化后直接掺入DNA，抑制DNA 甲基化转移酶，逆转DNA 高甲基化状态，恢复控制细胞分化增殖基因的正常功能从而发挥抗肿瘤作用。研究表明，地西他滨可促进肿瘤细胞衰老、凋亡，有效拮抗肿瘤形成，且治疗相关的骨髓抑制死亡率较低［2］。本研究主要探索地西他滨对AML 细胞增殖和凋亡的影响，为地西他滨在临床上更广泛用于治疗AML 提供更多基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）实验细胞系及培养方法白血病细胞株THP⁃1 和U937 由广州赛哲生物科技有限公司实验室馈赠。培养体系为含10%胎牛血清的1640 培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。（2）主要试剂与仪器RPMI1640 培养基（美国Gibico公司），胎牛血清（FBS，美国Gibico 公司），地西他滨（荷兰Pharmachemie B.V.公司），细胞增殖检测试剂盒（MTS）（美国Promega 公司），Annexin V⁃FITC∕细胞凋亡检测试剂盒（美国Sigma⁃aldrich公司），流式细胞仪（美国BD 公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo fisher 公司），多功能酶标仪（美国Perkin Elmer 公司）。

1.2 实验方法 （1）取对数生长期的THP⁃1 和U937 接种于96 孔板，接种浓度为5×104∕孔，地西他滨作用浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol∕L，每孔终体积为200 μl，复种3 孔；分别观察作用24、48、72 及96 h 后THP⁃1 和U937 细 胞存 活 情况。（2）细胞增殖实验：取对数生长期的THP⁃1 和U937 细胞，调整密度为5×104∕ml，每孔50 μl 接种于96 孔板中，加入含10%胎牛血清配制的地西他滨溶液（1 μmol∕L）50 μl，设3 个复孔，并设不加药培养的THP⁃1 和U937 细胞为对照组，另设不含细胞的培养液为空白组，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24、48、72 及96 h 后，每孔加入20 μl 的MTS 溶液，在培养箱孵育1-4 h，用酶标仪测定490 nm 处的吸光度值（OD 值），实验重复3 次。细胞存活率（%）=［（OD 实验孔-OD 空白孔）∕（OD对照孔-OD 空白孔）］×100%。（3）凋亡检测：用PBS洗涤细胞二次（2 000 rpm 离心5min）收集细胞；加入500 μl 的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μl Annexin V⁃FITC 混 匀 后，加 入5 μl Propidium Io⁃dide，混匀；室温、避光、反应5-15 min；用流式细胞仪检测：FITC：Ex∕Em=495 nm∕519 nm，PI：Ex∕Em=535 nm∕617 nm；荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

1.3 统计学方法 运用SPSS 19.0 统计软件建立数据库并进行统计分析。符合正态分布的计量资料用（±s）描述；两组均数的比较用独立样本的t检验；三个时间点重复测量的MTS 结果采用重复测量设计的方差分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度地西他滨对THP⁃1 细胞株增殖率的影响 见表1。

表1 不同浓度地西他滨作用于THP⁃1 细胞株细胞增殖率比较（±s，%）

表1 不同浓度地西他滨作用于THP⁃1 细胞株细胞增殖率比较（±s，%）

注：与0 μmol∕L 组比较，*P<0.05。

浓度（μmol∕L）0 μmol∕L 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1.0 μmol∕L 2.0 μmol∕L 24 h 99.51±1.65 94.60±3.60*92.42±2.75*90.37±0.49*91.49±1.64*48 h 97.72±3.87 90.42±2.75*91.79±4.81*87.47±6.35*79.16±8.42*72 h 94.91±2.24 91.79±4.8*71.46±7.5*62.03±6.11*59.16±7.10*96 h 92.21±2.14 91.86±5.40 50.19±4.21*32.17±3.27*27.31±4.28*

2.1 不同浓度地西他滨对U937 细胞株增殖率的影响 见表2。

表2 不同浓度地西他滨作用于U937 细胞株细胞增殖率比较（±s，%）

表2 不同浓度地西他滨作用于U937 细胞株细胞增殖率比较（±s，%）

注：与0 μmol∕L 组比较，*P<0.05。

96 h 92.18±4.86 87.53±6.38*62.74±5.32*38.07±5.76*30.50±3.65*浓度（μmol∕L）0 μmol∕L 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1.0 μmol∕L 2.0 μmol∕L 24 h 99.4±2.23 95.56±3.67 96.52±7.19 98.56±1.79 93.11±4.32*48 h 95.67±5.32 90.40±2.16*87.40±5.52*79.03±11.04*75.61±4.62*72 h 93.59±3.47 88.21±9.33*73.31±8.78*52.87±3.15*50.57±2.91*

2.2 地西他滨促进急性髓系白血病细胞株凋亡 见表3、表4 及图1。

表3 地西他滨作用于THP⁃1 细胞株凋亡率比较（±s，%）

表3 地西他滨作用于THP⁃1 细胞株凋亡率比较（±s，%）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别对照组地西他滨组24 h 5.81±1.87 18.56±5.60*48 h 7.65±3.16 53.4±2.75*72 h 6.66±2.24 77.79±11.68*96 h 8.84±3.76 87.86±6.04*

表4 地西他滨作用于U937 细胞株凋亡率比较（±s，%）

表4 地西他滨作用于U937 细胞株凋亡率比较（±s，%）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别对照组地西他滨组24 h 5.37±0.77 14.20±2.68*48 h 7.50±1.96 41.37±2.18*72 h 5.90±1.70 67.58±2.88*96 h 9.73±2.40 80.54±9.37*

图1A、B 地西他滨促进急性髓系白血病细胞株凋亡

3 讨 论

AML 是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度异质性的白血病细胞大量增殖，造成造血抑制及侵犯肝、脾、淋巴结及其他器官，是成人常见的急性白血病类型［3］。目前年轻AML 患者的治疗手段主要有化疗、靶向治疗及造血干细胞移植等，部分患者通过有效的治疗能得以长期生存［4］。但对于老年AML 患者，由于多脏器储备功能下降、合并症多及很多患者存在不良细胞遗传学及分子生物学异常，大部分患者不能耐受标准强度化疗及容易出现化疗药物耐药。

白血病的发病机制与表观遗传改变密切相关，主要包括DNA 甲基化、组蛋白共价修饰、核小体重塑、microRNA 及长链非编码RNA 等［5］。其中DNA 过度甲基化而使抑癌基因失活导致白血病发生发展，地西他滨为DNA 甲基转移酶抑制剂，可重新激活因DNA 过度甲基化而失活的抑癌基因，促进白血病细胞分化、衰老及凋亡，从而起到治疗肿瘤的作用，目前已经被广泛应用于MDS 及AML的治疗。但是，地西他滨单药治疗存在反应率低、持续时间短以及治疗失败后再治疗效果差等问题［6］。齐瑶等研究表明，地西他滨联合减量FLAG方案治疗老年高危AML 患者可以显著提高CR率，患者耐受性良好，可作为老年高危AML 首选诱导缓解方案之一［7］。

为了更好研究地西他滨的作用机制，本课题组通过体外实验发现，地西他滨在急性髓系白血病中能调控细胞增殖，地西他滨作用于THP⁃1 和U937AML 细胞株24 h 后，细胞增殖无明显变化，但随着地西他滨作用时间的延长及浓度的增加，药物作用48、72 及96 h 后，细胞增殖均受到不同程度抑制，作用时间越长及浓度越高，细胞增殖越差（见表1 及表2）。地西他滨作用72 及96 h 后，与无地西他滨作用的对照组相比，细胞增殖率显著降低（P值均<0.01）。同时，地西他滨能抑制AML 细胞株THP⁃1 和U937 增殖及促进凋亡的作用。这和文献报道地西他滨在其他肿瘤的调控功能相吻合。今后，我们将增加地西他滨在难治复发AML和老年AML 患者中的临床研究，进一步验证它的治疗效果及探索调控机制，为地西他滨在AML 治疗中的作用提供更多临床数据。