MicroRNA-613调控ATOH1 和FMNL2对结肠癌发生发展的影响

查作霖，陈福军

（佳木斯大学附属第一医院肛肠科，黑龙江 佳木斯 154007）

目前，结肠癌（colon cancer）已成为最常见的恶性肿瘤之一，每年有超过100 万新发病例[1]。尽管结肠癌的治疗方法多种多样，但结肠癌患者的生存率仍然很低[2]。结肠癌的发生和发展与很多代谢与分子机制相关[3]。因此，了解结肠癌发生和发展的分子机制，发现新的分子诊断标志物和治疗靶点的药物具有重要意义。越来越多的医学研究表明微小RNA（MicroRNA）参与了结肠癌的发生和发展。MicroRNA-613 在许多癌症中有抑癌作用。然而，关于MicroRNA-613 在结肠癌中的具体分子机制和调控作用尚不清楚。MicroRNA 是大小为19～25 个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶mRNA的3’-UTR结合从而负调控基因表达[4-6]。MicroRNA 在许多不同的生物代谢过程中起着至关重要的作用，包括细胞增殖、分化和凋亡等[7,8]。MicroRNA-613 在结肠癌组织和患者血液样本中表达增加，其可能抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并在G1期诱导细胞周期阻滞。通过生物信息学分析发现，在结肠癌细胞中，ATOH1 和FMNL2的mRNA的3’-UTR 与MicroRNA-613 有结合位点。且ATOH1 和FMNL2的异常表达可能影响MicroRNA-613 诱导的结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭[9,10]。这些研究结果表明MicroRNA-613 通过调节ATOH1 和FMNL2 在结肠癌的发展中发挥重要作用。本研究重点验证MicroRNA-613 在结肠癌发生和发展中的作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 miRcute 血清/血浆miRNA 提取分离试剂盒（天根生化科技有限公司）；miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司）；miRNA荧光定量检测试剂盒（天根生化科技有限公司）；无RNA 酶双蒸水（天根生化科技有限公司）；miRNA 检测引物has-U6（天根生化科技有限公司）；miRNA 检测引物has-miR-613（天根生化科技有限公司）等。

1.2 实验仪器 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）、琼脂糖凝胶电泳仪（美国BIO-RAD 公司）、反转录PCR（美国ABI 公司）、Eppendorf U410-86 低温冰箱（德国eppendorf 公司）、上海天能Tanon 凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）、SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 组织标本收集 收集2019 年12 月-2020 年12月在佳木斯大学附属第一医院肛肠科手术治疗的结肠占位患者的结肠癌组织及癌旁正常肠组织，包括病理低分化、高分化和正常组织各20 例，分别作为轻度组、重度组和对照组。组织标本离体后迅速冷冻至液氮中，并保存在-80 ℃冰箱中，直至RNA 提取。纳入标准：①病理确诊为结肠癌、TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期的患者，且手术方式为根治性手术；②未接受过任何肿瘤相关性手术、放化疗及其他肿瘤相关治疗；③为原发肿瘤。排除标准：合并心、肝、肾等其他器官功能障碍者。

1.3.2 血液标本收集 采集所有受检者清晨空腹静脉血10 ml，室温下3000 r/min 离心10 min，移去细胞或细胞碎片；收集上层血清，然后在4 ℃，3000 r/min 离心10 min，进一步除去残留血细胞；小心吸取上层血清至新的离心管，置于80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 qRT-PCR 检测miR-613 表达 应用实时荧光定量PCR 技术（qRT-PCR）检测各组组织标本、血液标本中miR-613的表达水平，比较各组表达水平的差异。组织标本、血液标本中的miRNA 提取分离；合成miRNA cDNA 第一链琼脂糖凝胶电泳检测cDNA。反转录程序：①RNA 加A 尾反应和反转录反应42 ℃，60 min；②酶失活反应95 ℃，3 min。miRcute增强型miRNA 荧光定量检测；按实验样本数量计算各试剂总量，分装到反应管中，最后加入反应体系中的自备引物和miRNA cDNA。按顺序加入试剂：2×miRcute 增强型microRNA 定量预混试剂、Reverse Primer、50×ROX 对照染料和引物，加入1.5 ml 无RNA 酶离心管中，最后加入样本的cDNA。混匀，离心，上机，设置反应程序，观察结果。

1.3.4 ELISA 实验 酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定结肠癌患者组织Atoh1，FMNL2的水平。

1.3.5 Western Blot 分析FMNL2 和Atho1 表达 蛋白裂解：组织加入裂解液，4 ℃裂解2 h 后，12,000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清，放于液氮罐或-80 ℃冰箱中，每次电泳之前进行蛋白测定。裂解蛋白的含量测定，蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗、二抗反应，显色反应，凝胶图象分析。

1.4 统计学方法 所有实验数据采用SPSS 25.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较采用Student’st检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性采用Pearson 线性相关分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电泳情况 miRNA 经逆转录生成cDNA 后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。qRT-PCR 检测各组样本，溶解曲线分析未见杂峰，扩增产物单一，没有非特异性扩增，所有样品均己进入扩增平台期，反应条件设定准确。

图1 组织样本cDNA 琼脂糖凝胶电泳图

2.2 各组组织匀浆中ATOH1 和FMNL2 表达比较对照组、轻度组、重度组组织匀浆中ATOH1 表达量逐渐升高，各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组、轻度组、重度组组织匀浆中FMNL2 表达量逐渐降低，各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组组织匀浆中ATOH1 和FMNL2 表达比较（，ng/ml）

表1 各组组织匀浆中ATOH1 和FMNL2 表达比较（，ng/ml）

注：**表示与对照组比较，P＜0.05

2.3 各组组织中ATOH1 和FMNL2 表达比较 对照组、轻度组、重度组组织中ATOH1 表达量逐渐升高，各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组、轻度组、重度组组织中FMNL2 表达量逐渐降低，各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图2、图3。

表2 各组组织样本中ATOH1 和FMNL2 表达量比较（）

表2 各组组织样本中ATOH1 和FMNL2 表达量比较（）

注：**表示与对照组比较，P＜0.05

图2 Western Blot 分析FMNL2的表达

图3 Western Blot 分析ATOH1的表达

2.4 各组组织样本中miRNA-613 表达比较 对照组、轻度组、重度组miRNA-613 表达水平逐渐升高，且各组miRNA-613 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组组织样本中miRNA-613 表达比较（）

表3 各组组织样本中miRNA-613 表达比较（）

注：**表示与对照组比较，P＜0.05

2.5 miRNA-613 和ATOH1、FMNL2的相关性 Pearson 相关性分析显示，miRNA-613 和ATOH1、FMNL2 表达均呈负相关，见表4。

表4 miRNA-613 与ATOH1 和FMNL2的相关性

3 讨论

miRNA 是一类重要的小分子，在转录后调控蛋白质过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明，miRNA的表达失调与结肠癌的发生发展有关。miRNA-613 在许多癌症中起着抑癌作用，但目前miRNA-613 在结肠癌进展中的确切作用尚不清楚。结肠癌的发生是由于癌细胞无限增殖和不受调控，癌基因和原癌基因被激活，抑癌基因被抑制引起的[11]。研究认为，miRNA 和蛋白质表达量的变化和结肠癌的发生密不可分。

研究发现[12]，miRNA-613 通过靶向ATOH1 促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移，该研究发现了miRNA-613 在结肠癌中的表达和功能，并阐明了miRNA-613调控结肠癌进展的分子机制。另外，miRNA-613 在结肠癌组织样品和人结肠癌细胞系中上调，这也促进了增殖、侵袭和迁移的结肠癌细胞数量。双重荧光素酶报告基因测定证实ATOH1 是miRNA-613的目标mRNA，Jun N 端激酶1（JNK1）通路和粘蛋白2（MUC2）是miRNA-613/ATOH1的潜在下游蛋白。另有研究发现[13]，miRNA-613 可靶向FMNL2 并抑制结肠癌的进展。miRNA-613 在结肠癌细胞系和组织样本中表达量的变化，说明其可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导G1期细胞周期停滞。而FMNL2 是结肠癌细胞中miRNA-613的直接结合靶点，FMNL2的过表达可影响miRNA-613 诱导的结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。因此，目前研究认为miRNA-613 主要通过调节FMNL2 在结肠癌的表达发挥抑癌作用。

本次研究显示，各组样本中miRNA-613的表达水平均高于对照组，同时重度组高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA 实验表明，与对照组相比，ATOH1 表达增高，且重度组高于轻度组；而FMNL2 表达降低，且重度组低于轻度组。另外，通过miRNA-613 与ATOH1 和FMNL2的相关性分析发现，miRNA-613的表达和ATOH1、FMNL2的表达均呈负相关（P<0.05），说明miRNA-613 是结肠癌的致癌基因，并通过靶向ATOH1、FMNL2促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移，其可能是通过激活JNK1 途径和上调MUC2 发挥作用，miRNA-613 有望成为治疗结肠癌的新药物的干预靶点。miRNA-613调控ATOH1 和FMNL2 在结肠癌发生发展中有重要的分子作用，进而可以作为预测结肠癌严重程度的分子指标[14-16]。未来，miRNA-613、ATOH1 和FMNL2 可能成为临床上快速诊断结肠癌的重要分子标志物。

综上所述，miRNA-613 通过影响ATOH1 和FMNL2的表达，从分子水平上调控结肠癌的发生发展。另外，miRNA-613的表达与ATOH1 和FMNL2均呈负相关，可互相作为分子标志物。但是其调控结肠癌具体分子机制尚未完全明确，还需进一步的研究验证。