陕西省杨凌区蔬菜基地土壤中抗生素污染评价

李国秀，崔利辉，刘颖沙

(杨凌职业技术学院生物工程分院，陕西 杨凌 712100)

0 引言

随着社会经济的快速发展，人们对高品质食品尤其是有机食品的需求日益增加。目前全球有上百个国家开展有机农业生产，我国自21世纪以来也大力发展有机农业，有机农业面积达300万hm2，为全球第3大有机食品生产国和消费国[1]。与传统农业模式不同，有机农业禁用农药、化肥等合成品，提倡使用有机肥并对产地环境质量有严格要求。因此，大多有机农场均直接或间接地使用禽畜粪便作为肥料，并导致其中污染物大量进入土壤[2-4]。

抗生素是禽畜粪便中的主要污染物之一，施用禽畜粪肥或用养殖废水灌溉可导致抗生素大量进入农田土壤，进而被农作物吸收积累，并威胁人类健康[5-7]。蔬菜是人们日常生活中必不可少的食物，也是十分重要的经济作物，其安全性是政府及老百姓十分关注的问题，也是农产品提质增效及可持续发展所面临的重要问题。大量研究表明，蔬菜可从土壤中吸收并积累抗生素[8-10]。本研究对陕西省杨凌区及其周边蔬菜基地土壤中的抗生素污染状况进行了全面的检测分析，可为本地区蔬菜的安全生产、保障蔬菜的质量安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB4500型三重四极杆液质联用仪(美国AB Sciex公司)；OSJ-UP-V型超纯水机(山东博科科学仪器有限公司)；RE-52C型旋转蒸发仪(郑州市亚荣仪器有限公司)；水浴恒温振荡器(上海启前电子科技有限公司)；MD-200型氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；Mixplus型旋涡混合器(合肥艾本森科学仪器有限公司)；KQ-AS1000GVDE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6090型真空干燥箱(济南欧莱博科学仪器有限公司)；TG1650-WS型台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；AR2140型电子天平(美国奥豪斯)；SPE-12型固相萃取装置(天津艾维欧科技发展有限公司)。

19种抗生素(表1)标准溶液(100 μg/mL，购自北京坛墨质检科技有限公司)；甲醇和乙腈为色谱纯；85%磷酸、36%冰醋酸、柠檬酸、正己烷、盐酸、无水硫酸钠、十二水合磷酸氢二钠、乙酸铵和乙二胺四乙酸二钠均为分析纯，试验用水均为超纯水。

表1 4类抗生素质谱条件参数

1.2 样品采集与预处理

杨凌位于陕西关中平原中部，属陕西省咸阳市辖区，是全国农业高新技术产业示范区。2018年10月—2019年9月，在杨凌示范区及周边的扶风县绛帐镇、武功县武功镇、周至哑柏镇等共选取20个蔬菜生产基地进行采样，按照HJ/T 166—2004《土壤环境监测技术规范》进行土壤样品采集[11]。

每个采样基地均采用5点采样法，采取0～20 cm表层土壤样品进行混合，将待测土壤样品平铺在风干盘上，去除土壤中的杂物，放于通风阴凉处自然风干，研磨后过60目筛，置于冰箱密闭避光保存，待测。

1.3 土壤样品前处理

参考文献报道的方法，对不同种类抗生素分别进行以下不同预处理[12-14]。

1.3.1 喹诺酮类抗生素前处理

准确称取1.00 g土壤样品，置于10 mL离心管中，加入50%硝酸镁-10%氨水(96/4，v/v)5 mL，振荡5 min，超声提取15 min，以4 500 r/min离心10 min，收集上清液。残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液，再过HLB固相萃取小柱(先后过6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高纯水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL 1%乙酸-乙腈洗脱小柱。洗脱液在40 ℃下用氮气吹至近干，用乙腈-水(20/80，v/v)定容至1 mL，溶液过0.22 μm滤膜，收集于样品瓶中待测。

1.3.2 四环素类抗生素前处理

准确称取1.00 g土壤样品置于10 mL离心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液/甲醇(1/1，v/v)5 mL，振荡5 min，超声提取15 min，以4 500 r/min离心10 min，收集上清液。残渣按上述方法反复提取2次，合并上清液。旋转蒸发至体积不变，再过HLB固相萃取小柱(先后过6 mL甲醇和6 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液)萃取富集。用6 mL高纯水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脱小柱。洗脱液在40 ℃下用氮气吹至近干，用甲醇-水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液过0.22 μm滤膜，收集于样品瓶中待测。

1.3.3 磺胺类和大环内酯类抗生素前处理

准确称取1.00 g左右土壤样品置于10 mL离心管中，加入柠檬酸-MgCl2缓冲液/乙睛(1/1，v/v)5 mL，振荡5 min，超声提取15 min，以4 500 r/min离心10 min，收集上清液。残渣按上述方法反复提取2次，合并上清液。旋转蒸发至体积不变，再过HLB固相萃取小柱(先后过6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高纯水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脱小柱。洗脱液在40 ℃下用氮气吹至近干，用甲醇-水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液过0.22 μm滤膜，收集于样品瓶中待测。

1.4 抗生素检测方法

采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)对土壤样品中4大类19种抗生素(表1)进行检测。

1.4.1 色谱条件参数

色谱柱：Kinetex Bipheny C18(50 mm×30 mm，2.6 μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序(B%)：0～5 min 20%～90%，5～7 min 90%；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

1.4.2 质谱条件参数

相关质谱参数如表1所示。质谱分析离子流如图1所示。

图1 质谱分析离子流Fig.1 Ion flow analyzed by mass spectrometry

1.5 数据处理

采用Excel 2013及SPSS 17.0软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 土壤中喹诺酮类抗生素含量特征

土壤样品中喹诺酮类抗生素含量特征如表2所示。在检测的20个土壤样本中，4种喹诺酮类抗生素总含量(ΣQNs)在14.64～103.37 μg/kg，平均含量为51.76 μg/kg。总含量分布情况如图2所示，<30 μg/kg的占20%，30～60 μg/kg的占45%，60～90 μg/kg的占25%，>90 μg/kg的占10%。诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检出率均为100%，洛美沙星的检出率为85%，且其中小部分(15.4%)低于定量限。4种化合物的平均含量从高到低依次为诺氟沙星>环丙沙星>恩诺沙星>诺美沙星。土壤中喹诺酮类化合物组成以诺氟沙星为主，其次为环丙沙星和恩诺沙星，而洛美沙星的含量很低。大部分土壤样品能同时检出4种喹诺酮类化合物，但各化合物的含量主要在50 μg/kg以下。本研究区域蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素含量低于邹慧云等[7]的报道(平均含量161.07 μg/kg)，与邰义萍[12]、赵慧男[15]、段夏珍[16]的报道结果相近。

表2 土壤中喹诺酮类抗生素含量特征

图2 土壤中喹诺酮类抗生素总含量区间分布Fig.2 Range distribution of total quinolone antibiotics content in soil

2.2 土壤中四环素类抗生素含量特征

由表3可知，四环素类抗生素总含量(ΣTCs)在2.41～36.96 μg/kg，平均值为12.77 μg/kg，全部低于50 μg/kg。总含量分布情况如图3所示，<10 μg/kg的占40%，10～30 μg/kg的占55%，30～50 μg/kg的占5%。4种四环素类化合物的检出率均高于80%，平均含量分别为6.62、1.15、3.91和1.09 μg/kg。土壤中4环素类化合物组成以土霉素为主，其次为金霉素，而四环素和强力霉素的含量较低。大部分土壤样品能同时检出4种四环素类化合物，但各化合物的含量主要在10 μg/kg以下。本研究区域蔬菜基地土壤中四环素类化合物含量低于张兰河等[17]、邰义萍等[18]、李彦文等[19]、郎朗等[20]的报道，污染程度较低。

表3 土壤中四环素类抗生素含量特征

图3 土壤中四环素类抗生素总含量区间分布Fig.3 Range distribution of total content of tetracycline antibiotics in soil

2.3 土壤中磺胺类抗生素含量特征

土壤样本中磺胺类抗生素的含量特征如表4所示。8种磺胺类化合物的总含量(ΣSAs)在0.10～2.94 μg/kg，平均值为1.14 μg/kg。仅磺胺二甲嘧啶(SM2)全部检出，最高含量为2.61 μg/kg，其余7种磺胺类化合物均<1 μg/kg。单个化合物平均含量顺序为磺胺二甲基嘧啶(SM2)>磺胺甲恶唑(SMZ)>磺胺对甲氧嘧啶(SM)>磺胺嘧啶(SD)>磺胺吡啶(SPD)>磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)>磺胺甲基嘧啶(SMl)>磺胺噻唑(ST)。因此，土壤中磺胺类抗生素以磺胺二甲嘧啶(平均值0.69 μg/kg)为主。成玉婷等[21]研究得出，广州市典型有机蔬菜基地土壤中磺胺类抗生素总含量在0.73～973 μg/kg，平均含量为116 μg/kg。张兰河等[17]研究得出，菜田温室土壤中磺胺类抗生素含量为4.13～34.70 μg/kg，平均含量为13.41 μg/kg，均高于本研究区域蔬菜基地土壤样本中磺胺类抗生素的含量，说明本研究区域污染水平较低。

表4 土壤中磺胺类抗生素含量特征

表5 土壤中大环内酯类抗生素含量特征

2.4 土壤中大环内酯类抗生素含量特征

土壤样本中大环内酯类抗生素含量特征如表5所示。总含量在0(低于检测限)～10.13 μg/kg，平均含量为1.23 μg/kg。螺旋霉素、红霉素和罗红霉素检出率均很低，分别为20%、40%和15%。3个化合物平均含量从高到低依次为红霉素>螺旋霉素>罗红霉素，以红霉素为主。

3 结论

对杨凌区及其周边20个蔬菜生产基地的土壤样品中喹诺酮类、四环素类、磺胺类、大环内酯类4大类19种抗生素的含量进行检测分析，结果表明，研究区域蔬菜基地土壤中喹诺酮类、磺胺类、四环素类3类抗生素均100%检出，大环内酯类抗生素的检出率为62%。

4类抗生素平均含量由高到低依次为喹诺酮类(51.76 μg/kg)>四环素类(12.77 μg/kg)>磺胺类(1.14 μg/kg)>大环内酯类(1.23 μg/kg)，分别以诺氟沙星、土霉素、磺胺二甲基嘧啶和红霉素为主。

目前，国内尚无土壤中抗生素的限量要求，根据兽药国际协调委员会(VICH)筹划指导委员会提出的土壤中抗生素生态毒害效应的触发值(100 μg/kg)，研究区域土壤中4大类抗生素的含量均小于该触发值，生态风险较小[21-22]。与国内其他地区的研究报道相比，本研究区域的蔬菜基地抗生素污染程度也处于相对较低的污染水平。

研究区域蔬菜基地土壤中4大类典型抗生素均有检出，说明土壤受到抗生素一定程度的污染。由于土壤中抗生素的积累会影响到土壤中正常微生物菌群的生长繁殖，而且会进一步迁移到种植的作物中，因此会危害生态环境安全和食品安全[5，23]。土壤中的抗生素主要来源于污水灌溉和畜禽粪便的直接施用，蔬菜生产从业人员应建立农产品质量安全意识，不用污水灌溉，合理施用有机肥，避免土壤中抗生素的积累。