花菊盆炎颗粒提取工艺研究

唐靖雯 潘梅 张丽艳 梁斌 卢礼平

【摘 要】 目的：確定花菊盆炎颗粒最佳提取工艺。方法：应用HPLC测定槲皮素含量，并与正丁醇浸出物总量的综合评分为考察指标，采用正交试验法L9（34）优选提取工艺条件。结果：最佳提取工艺为处方中头花蓼、醋延胡索、三七加7倍量60%乙醇提取3次，每次1.5 h，过滤得醇提液;野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢加10倍量的水煎煮3次、每次1 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15（60 ℃）的浸膏，放冷，加乙醇使药液含醇量达70%，静置后过滤，得水提醇沉液;合并上述滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.25（60 ℃）。结论：该工艺简单、稳定可行，对花菊盆炎颗粒的工业化生产具有一定的参考价值。

【关键词】 花菊盆炎颗粒;正交实验法;醇提法;水提醇沉法

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）12-0025-06

Abstract：Objective To optimum the extraction procedure of Huaju Penyan granules. Methods The content of quercetin was determined by HPLC，and the comprehensive score of the total amount of n-butanol extract was used as the index. The orthogonal test method L9（34） was used to optimize the extraction process conditions. Results The best extraction process was to extract Polygonum capitatum，Rhizoma Corydalis （made by vinegar） and Panax notoginseng with 7 times of 60% ethanol for 3 times，1.5 h each time，and then filtered to obtain the alcohol extract; Chrysanthemum indicum，Prunella vulgaris，cypermethrin and were decocted with 10 times amount of water for 3 times，each time for 1 h. After filtration，the filtrate was concentrated to the extract with a relative density of 1.10～1.15 （60 ℃），cooled，added with ethanol to make the alcohol content of the solution reach 70%. After standing and filtering，water extraction and alcohol precipitation were obtained; The above filtrate was combined，ethanol was recovered and concentrated to a relative density of 1.20～1.25 （60 ℃）. Conclusion The optimum extraction procedure is simple，stable and practical，which has a certain reference value for the industrial production of Huaju Penyan granules.

Keywords：Huaju Penyan Granules; Qrthogonal Test; Alcohol Extraction; Water Extracting-alcohol Precipitating

花菊盆炎颗粒是利用贵州苗药头花蓼优良的抗菌消炎活性特点，并结合中医药理论及名老中医的临床治疗经验，采用头花蓼为君药，配以野菊花、夏枯草、醋延胡索、茜草炭、三七、粉萆薢等六味中药组成经验方;由贵州威门药业股份有限公司自主研发的一种治疗女性慢性盆腔炎的纯中药复方制剂，属于国家6类中药新药。头花蓼中主要含有芦丁、槲皮素等黄酮类成分，溶于乙醇，具有明显的消炎、抗菌作用[1];野菊花中主要含有萜类化合物、黄酮类化合物等，水提液具有明显的抗菌、抗病毒、抗抑郁和消炎等作用[2];夏枯草的主要成分为三萜及其苷类、苯丙素类、黄酮类、香豆素等，其水提液具有广谱抗菌活性，消炎、镇痛等作用[3];延胡索中主要含异喹啉生物碱[4]，醋延胡索较生品有利于生物碱的溶出，且研究[5]表明60%乙醇提取效果最佳;茜草主要含有蒽醌及其苷类化合物，茜草炭水提取液有消炎、抗菌作用并能缩短小鼠的凝血时间[6];三七中的主要有效成分为三七总皂苷，易溶于乙醇溶液[7];粉萆薢中主要含有皂苷和甾体皂苷类化合物，皂苷和甾体皂苷类的成分易溶于水，且具有抗病原微生物、消炎等作用[8];根据处方中各味药物的有效成分及其理化性质，结合实际生产，采用醇提与水提醇沉相结合的提取工艺。其中，头花蓼、延胡索、三七采用乙醇提取;野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢采用水提醇沉;以槲皮素总量、正丁醇浸出物为综合考察指标，采用正交试验法对醇提、水提醇沉过程中的主要影响因素进行优选，确定最佳的提取工艺，为花菊盆炎颗粒的批量生产提供科学依据，为临床上治疗慢性盆腔炎提供一种疗效确切的新药制剂奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100型高效液相色谱仪（Agilent科技有限公司）;AG135型十万分之一电子天平（梅特勒托利多科技有限公司）;CH-250型超声波清洗器（北京创新德超声电子研究所）;101-5型电热恒温鼓风干燥箱（上海路达实验仪器有限公司）;SENCOR○R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）;予华牌循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.2 试药 头花蓼、野菊花、夏枯草等药材购于贵州省药材公司，所有药材均符合《中国药典》2000版（一部）或地方标准项下有关规定;花菊盆炎颗粒提取液（批号：040801、040802、040803）;槲皮素对照品（批号：10081-9905，纯度：96.5%，中国食品药品检定研究院）;甲醇、乙腈为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正丁醇浸出物含量测定 取浸膏粉样品约2g，精密称定重量，置100 mL的锥形瓶中，精密加入正丁醇50 mL，塞紧，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，称定重量，用正丁醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算样品中浸出物的含量。

2.2 槲皮素含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）;流速：1 mL·min-1;检测波长：360 nm;柱温：25 ℃;进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.01 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取浸膏粉约0.2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）混合液25 mL，密塞，称定重量，摇匀，水浴回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）混合液补足减失的重量，摇匀，静置，滤过，精密量取续滤液5mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.3 提取工艺条件的优选

2.3.1 头花蓼、醋延胡索、三七药材的醇提工艺研究 根据预试验的结果，以影响提取工艺的主要因素乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，以测得的君药头花蓼中槲皮素总量及浸膏收率为综合评价指标。每个因素3个水平，用正交表L9（34）进行优选，正交试验因素水平见表2。优选醇提工艺条件，正交试验结果见表3。

根据正交试验结果，以槲皮素含量及浸膏收率为评价指标，理论上的最佳提出工艺条件为A1B3C2D3，结合K值，根据表2方差分析结果表明，各因素作用的主次为D>A>C>B，并通过表3方差分析可知，A、C、D因素均具有极显著性差异（P<0.01）。最终确定最佳的提取工艺条件为A1B2C2D3组合为佳，即加7倍量60%乙醇提取1.5 h，共提3次。

2.3.2 野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢药材的水提工艺研究 根据预试验的结果，以影响提取工艺的主要因素加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，以测得的正丁醇浸出物的总量为评价指标。每个因素3个水平，用正交表L9（34）进行优选，正交试验因素水平见表4。优选水提工艺条件，正交试验结果见表5。

结果表明：由直观分析可知，各因素作用的主次为C>A>B;并由方差分析结果可知，A、B因素对结果没有显著性影响（P>0.05）、C因素对结果具有显著性影响（P<0.05），结合生产实际成本考虑，以组合A3B1C3为佳，即加10倍量水提取1 h，共提3次。

2.3.3 野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢药材的醇沉工艺研究 为了最大限度地除去水提液中的无效成分，尽可能地保留有效成分，本工艺采用醇沉的方法对水提液进行精制。以浸膏相对密度（A）、醇沉浓度（B）两个因素，每个因素三个水平进行优选。按“2.3.2”项下水煎煮最佳工艺A3B1C3条件提取，将所得的滤液平均分为三份，每一份分别浓缩至相应的密度后，按正交表L9（34）进行正交试验，正交试验因素水平见表7，结果见表8。

由表8极差值大小显示，各因素作用的主次为A>B;并由表9方差分析结果可知，A因素对结果具有极显著性影响（P<0.01），B因素具有显著性影响（P<0.05）;以A2B2组合为佳，即浸膏的相对密度在1.10～1.15之间，醇沉时使药液含醇量达70%。

2.4 验证试验 按处方称取头花蓼、醋延胡索、三七药材各3份，对上述“2.3.1”项下确定的最佳工艺条件进行验证，结果见表10;按处方称取野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢药材各3份，对上述“2.3.2”项下确定的水提工艺条件进行验证，结果见表11，并在此基础上，对“2.3.3”项下确定的醇沉工艺进一步的验证，结果见表12。验证结果表明该提取工艺可行，可用于工业生产。

3 讨论

3.1 评价指标性的选择 处方中头花蓼、醋延胡索、三七以60%乙醇提取，因头花蓼具有良好抗菌、抗炎作用，与该制剂的功能主治一致，故以君药头花蓼中槲皮素作为醇提工艺的评价指标，同时，考虑野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢中均含苷类成分，此类成分易溶于正丁醇中，因此，选择正丁醇浸出物的总量作为水提醇沉提取物的评价指标。

3.2 流动相的选择 按君药头花蓼现行标准《贵州省中药材、民族药材质量标准》[9]项下方法的流动相进行测定，其槲皮素出峰时间较长。本研究在该流动相的基础上改变其比例，经摸索选定流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40）分离效果较好，出峰时间短，且与其它成分无干扰;经样品峰纯度检查，证明为纯峰，故以甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40）为流动相。

3.3 提取工艺验证试验 该提取工艺验证试验中，分别对醇提、水提、醇沉工艺分别进行验证，从各部分的验证试验结果可发现该工艺稳定、可行，后续研究将增加整个提取过程的最终验证试验，以便进一步验证该工艺。

4 结论

根据处方中药物性质，本试验采用了乙醇提取法、水提醇沉法相结合的提取工艺。采用正交设计，以浸膏收率、槲皮素总量为评价指标，确定醇提工艺为头花蓼、醋延胡索、三七加7倍量60%乙醇提取3次，每次1.5 h，过滤得醇提液;以正丁醇浸出物总量、浸膏收率为评价指标，确定最佳水提醇沉工艺为野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢加10倍量的水煎煮3次、每次1 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15（60 ℃）的浸膏，放冷，加乙醇使药液含醇量达70%，静置后过滤，得水提醇沉液;合并上述滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.25（60 ℃）。

参考文献

[1]云成悦，顾曼琦，穆仕峰，等.头花蓼提取工艺的优化及其抗菌活性[J].中成药，2018，40（3）：725-729.

[2]劉亚敏，栗俞程，方晓艳，等.野菊花水提物抗抑郁作用的研究[J].中药新药与临床药理，2019，30（10）：1195-1199.

[3]张金华，邱俊娜，王路，等.夏枯草化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2018，49（14）：3432-3440.

[4]赵丽沙，董宇，寿旦.延胡索生物碱类化学成分及质量控制研究进展[J].中华中医药学刊，2017，35（2）：299-302.

[5]朱培春，陈志成.醋制延胡索提取溶剂的选择[J]. 西北药学杂志，1996（1）：18.

[6]余旭东，杨季菱.茜草与茜草炭药理作用比较研究[J].中国实验方剂学杂志，2007（9）：53-56.

[7]丁艳芬，陈金东，黎福南，等.三七总皂苷超声波提取工艺研究[J].中国现代中药，2012，14（1）：38-40.

[8]陈冲，曾臣红，张斯琪，等.萆薢的研究进展[J].中国中药杂志，2017，42（18）：3488-3496.

[9]贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵州：贵州科技出版社，2003：147.

（收稿日期：2020-12-01 编辑：刘斌）