微小RNA-6783-3p通过靶向Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白1基因表达抑制胃癌细胞的增殖和迁移

顾园 常城 滕小军 黄耿 王品发

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院消化内科435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科435000

胃癌起源于胃黏膜上皮细胞，是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均较高［1］。胃癌的增殖和转移是导致患者预后较差的重要因素［2］。因而，探究胃癌的增殖和转移机制对胃癌的治疗具有重要临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一种18～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA［3］。miRNA通过诱导形成靶基因mRNA的沉默复合体，在转录后水平调控基因的表达［4］。研究显示，miR-6783-3p在肺腺癌、肝癌中异常表达，与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、化疗敏感性有关［5］。miR-6783-3p在胃癌中的表达和功能尚无文献报道。本研究旨在观察miR-6783-3p是否通过调节Ⅲ型纤维连接蛋白域 蛋 白1（fibronectin typeⅢdomain-containing protein 1，FNDC1）基因表达影响胃癌细胞的增殖和迁移能力。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 胃癌细胞购于中国科学院上海细胞所；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒、超敏电化学发光（ECL）试剂盒购于美国Thermo公司；Lipofectamine 3000转染试剂购于美国Invitrogen公司；一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国CST公司；miR-6783-3p模拟物、阴性对照序列、FNDC1 mRNA 3’-UTR野生型（FNDC 1-WT）序列及FNDC1 mRNA 3’-UTR突变型（FNDC1-MT）序列购于上海吉玛有限公司。

1.2 细胞培养和转染 将BGC823细胞加入10%胎牛血清RPMI-1640培养基，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。收集对数生长期的BGC823细胞，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书，转染阴性对照序列（对照组）和miR-6783-3p模拟物（试验组）。

1.3 qRT-PCR检 测miR-6783-3p和FNDC1 mRNA的表达 在细胞中加入1 ml TRIzol，提取总RNA，定量检测后逆转录合成cDNA。miR-6783-3p以U6作为内参照，FNDC1 mRNA以GAPDH作为内参照。miR-6783-3p：正向引物5’-CUACAGAGGAGAAGCCCA-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6：正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；FNDC1：正向引物5’-GCCAAGGCATGTGAAACTGC-3’，反向引物5’-CTGGTAGCATCTTTGGGTGGG-3’；GAPDH：正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。取引物和cDNA根据qRT-PCR试剂盒说明书检测基因的表达，采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

1.4 CCK-8法检测BGC823细胞的增殖能力 收集两组BGC823细胞，以200µl/孔接种于96孔板，在培养箱中培养5 d，在隔天相同时刻行CCK-8法检测。每孔加入30µl浓度为5 g/L的CCK-8试剂，在培养箱避光孵育2.5 h，使用酶标仪读取每孔在450 nm波长处的吸光度（A）值。

1.5 划痕愈合试验检测BGC823细胞的迁移能力 收集两组BGC823细胞，用无血清RPMI-1640培养基重悬后接种于6孔板。使用200µl枪头在6孔板底划痕，加入无血清培养基。于倒置显微镜下记录划痕的宽度，即0 h划痕宽度。继续培养24 h后，在同一测量点记录划痕宽度，即24 h划痕宽度。细胞划痕愈合率＝（0 h划痕宽度－24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.6 在线工具预测miR-6783-3p的靶基因 使用microRNA.org、DIANA-microT在线工具预测miR-6783-3p的靶基因，miR-6783-3p的靶基因可能是FNDC1。

1.7 双荧光素酶报告基因试验验证miR-6783-3p的靶基因 构建FNDC1-WT和FNDC1-MT荧光素酶表达载体，将其和/或阴性对照序列、miR-6783-3p模拟物共转染至BGC823细胞。培养48 h后，依据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，使用生物发光检测仪读取荧光值，计算荧光素酶相对活性。

1.8 蛋白质印迹法（Western blotting）检测靶基因表达 收集各组BGC823细胞提取总蛋白，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，每个泳道加入40µg总蛋白进行电泳、转膜。在含5%脱脂奶粉的PBS溶液中封闭3 h，加入一抗在4℃过夜孵育。洗膜后加入二抗，室温孵育2 h。洗膜后采用ECL化学法显色，在显色凝胶成像分析系统分析目的蛋白表达。

1.9 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，两组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 qRT-PCR检测两组细胞中miR-6783-3p表达水平 对照组和试验组BGC823细胞中miR-6783-3p的表达分别为（1.02±0.12）、（12.75±2.02），试验组miR-6783-3p的表达是对照组的12.50倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 miR-6783-3p对BGC823细胞增殖的影响 如图1，与对照组相比，试验组BGC823细胞在第3、4、5天的A值明显降低（均P＜0.05），提示miR-6783-3p可抑制胃癌BGC823细胞增殖。在第1、2天，两组细胞A值差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 miR-6783-3p对BGC823细胞增殖能力的影响

2.3 miR-6783-3p对BGC823细胞迁移的影响 对照组和试验组BGC823细胞划痕愈合率分别为（63.55±8.28）%、（28.79±6.26）%。与对照组相比，试验组BGC823细胞划痕愈合率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；表明miR-6783-3p可抑制胃癌BGC823细胞迁移。

2.4 双荧光素酶报告基因试验验证miR-6783-3p的靶基因 双荧光素酶报告基因试验显示，试验组1（野生型+miR-6783-3p）、试验组2（突变型+miR-6783-3p）、阴性对照组1（野生型+阴性对照序列）、阴性对照组2（突变型+阴性对照序列）荧光素酶相对活性分别为（1.01±0.10）、（0.40±0.08）和（0.97±0.06）、（1.01±0.13），与试验组1相比，试验组2的荧光素酶相对活性明显较低（P＜0.01）；表明miR-6783-3p可互补结合FNDC1基因mRNA 3’UTR。

2.5 miR-6783-3p对FNDC1 mRNA表达水平的影响对照组和试验组BGC823细胞中FNDC1 mRNA的表达分别为（0.26±0.03）、（1.02±0.07），差异有统计学意义（P＜0.01）；表明miR-6783-3p可有效抑制FNDC1 mRNA的表达。

2.6 FNDC1和增殖、迁移相关蛋白的表达Western blotting结果（图2）表明，试验组BGC823细胞FNDC1蛋白表达明显降低，细胞增殖蛋白PCNA、Ki67表达降低，细胞迁移蛋白Slug、Zeb2表达降低，提示BGC823细胞增殖和迁移能力降低。

图2 miR-6783-3p对FNDC1蛋白和增殖、迁移相关蛋白表达的影响

3 讨 论

miRNA可精确调控多个基因的表达，同一个基因也可被多个miRNA组合调控，miRNA的表达对细胞正常生物学行为的维持具有重要意义［3］。胃癌组织具有独特的miRNA表达特性和功能［6］。miRNA在不同恶性肿瘤中的表达程度不同，因而表现的功能也不相同，既可作为癌基因促进肿瘤的发展，也可作为抑癌基因抑制肿瘤的发生［7］。Dong等［5］研究发现，沉默linc01559表达可促进miR-6783-3p的表达，抑制肝癌细胞的增殖和迁移，miR-6783-3p的表达水平与肝癌患者的生存率、肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性相关。Yao等［8］研究发现，circ_0006427可通过下调miR-6783-3p的表达抑制肺腺癌的进展。miR-6783-3p对胃癌增殖和迁移能力的影响尚不清楚。

本研究通过转染miR-6783-3p模拟物后，发现转染miR-6783-3p模拟物后BGC823细胞的增殖和迁移能力均明显降低，说明miR-6783-3p可以抑制胃癌BGC823细胞的增殖和迁移能力。miRNA在肿瘤细胞生物学行为中的作用与其靶基因的功能密切相关［4］。本研究利用microRNA.org、DIANA-microT在线工具预测miR-6783-3p的靶基因，miR-6783-3p可能与FNDC1基因mRNA配对结合。双荧光素酶报告基因试验同样证实FNDC1基因是miR-6783-3p的靶基因。FNDC1基因位于6号染色体，FNDC1蛋白属于FNDC家族［9］。FNDC1在食管癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织表达增加，其表达水平与肿瘤的生长、淋巴结转移、放疗敏感性、化疗耐药性等关系密切［10］。FNDC1在胃癌组织中高表达，与胃癌患者的临床分期、病理分级正相关，FNDC1高表达是胃癌患者预后不良的独立预测因子［11］。本研究发现，转染miR-6783-3p模拟物可明显抑制FNDC1基因表达。FNDC1基因表达降低，细胞增殖蛋白PCNA、Ki67表达降低，细胞迁移蛋白Slug、Zeb2表达降低，提示BGC823细胞增殖和迁移能力降低。

综上所述，miR-6783-3p可通过FNDC1抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。miR-6783-3p为胃癌的分子靶向治疗提供了一定的理论依据。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。