高效液相色谱法同时测定骨炎消方中8种有效成分的含量

2021-09-04李田洋杨婷婷张琪王宝娟郑曙光贵州中医药大学贵阳55005贵州中医药大学第一附属医院贵阳55000

中南药学 2021年8期

李田洋，杨婷婷，张琪，王宝娟，郑曙光*（.贵州中医药大学，贵阳 55005；.贵州中医药大学第一附属医院，贵阳 55000）

骨炎消方为贵州中医药大学第一附属医院临床经验方，由狗脊、透骨香、飞龙掌血、蜘蛛香、大血藤、小血藤、黑骨藤、鸡血藤、伸筋草、骨碎补、杜仲、淫羊藿等12 味药材组成，具有消肿止痛、祛风除湿、舒筋活络、通气散血的功效。临床常用来治疗骨性关节炎、股骨头坏死等疾病，疗效显著[1-4]。方中大血藤、小血藤、黑骨藤、鸡血藤为藤本类植物，苗医认为这类植物细长蔓延与人体的筋脉相似，大都具有舒通筋脉和通气散血的作用[5]。鸡血藤具有补血的功用[6]，为软骨提供所必须的物质；杜仲、狗脊能补肾强骨，狗脊还可祛风除湿；蜘蛛香、透骨香能祛风除湿、表出毒邪，使机体祛除“外毒内乱”，恢复正常的状态，蜘蛛香还能理气和中、调理脾胃，使气血能够得到不断的补充；飞龙掌血、伸筋草舒筋活络、祛风除湿、消肿解毒；淫羊藿、骨碎补补肾强骨，活血止痛。诸药合用，既能调节内乱，排除毒素又能打通筋脉，提供气、血，达到治愈疾病的目的。

本课题组前期已进行骨炎消方制备工艺及临床疗效研究[7-9]，尚未见其有效成分含量测定的报道。为了更有效地控制骨炎消方的质量，提高临床疗效，本研究建立HPLC 法同时测定骨炎消方中原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯等8 种成分的含量，以期为骨炎消方的质量评价提供科学依据，同时为民族民间验方药物制剂的进一步研发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；超声波清洗器（上海乔跃电子有限公司，JOYN-10A）；水浴锅（上海双捷实验设备有限公司，DRHH-S8）；万分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E）；十万分之一天平（日本岛津公司，ADW120D）；循环水式多用真空泵（郑州科达机械仪器设备有限公司，SHZ-111）。

1.2 试药

狗脊（批号：190501）、大血藤（批号：190301）、小血藤（批号：190601）、鸡血藤（批号：200301）、伸筋草（批号：190701）、骨碎补（批号：200401）、杜仲（批号：200501）、淫羊藿（批号：191101）饮片（购自贵州同济堂中药饮片有限公司、贵阳德昌祥药业有限公司、贵阳同仁堂药店）；飞龙掌血、蜘蛛香、黑骨藤、透骨香均（购自贵阳市万东桥药材市场），以上药材均经贵州中医药大学药学院王波讲师鉴定为正品。原儿茶酸（批号：H21J9Z64031）、绿原酸（批号：Y20A11K111541）、原儿茶醛（批号：TO1013FB14）、咖啡酸（批号：W16O10B100366）、表儿茶素（批号：K19J9R66088）、柚皮苷（批号：24N9Z75896）、淫羊藿苷（批号：T05D9B76755）、茴芹内酯（批号：Y01025SB14）对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；乙腈（色谱纯，TEDIA 天地试剂公司）；甲醇（色谱纯）、磷酸（优级纯）（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用AgilentSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0 ～15 min，18%A；15 ～16 min，19%A；16 ～30 min，33%A；30 ～33 min，35%A；35 ～50 min，48%A），流速：0.8 mL·min－1；检测波长：270 nm；柱温：28℃。在此条件下，8 种成分分离度较好（见图1）。

图1 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution （A）and sample solution（B）

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯对照品适量，用甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为0.382、0.264、0.182、0.292、0.16、0.298、0.494、0.846 mg·mL－1的对照品储备液，精密吸取各对照品储备液1.0 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

称取12 味药材各15 g，加8 倍量水，浸泡2 h后煎煮1 h，滤过，保留滤液Ⅰ；药渣再加入6 倍量的水，煎煮2 次，每次0.5 h，滤过，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ合并，搅拌，使其混合均匀后加热浓缩成浸膏，制作成浸膏干粉备用。取骨炎消浸膏干粉2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密称取对照品原儿茶酸4.012 mg、绿原酸3.134 mg、原儿茶醛2.216 mg、咖啡酸2.564 mg、表儿茶素1.786 mg、柚皮苷3.467 mg、淫羊藿苷5.751 mg、茴芹内酯6.847 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中加甲醇至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以质量浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果表明各化合物在相应范围内与峰面积线性关系良好，见表1。

表1 各种成分的线性关系Tab 1 Linearity of various constituents

2.4.2 精密度试验精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续测定6 次，计算原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯色谱峰峰面积的RSD（n＝6）分别为1.5%、0.76%、1.6%、1.4%、1.5%、1.4%、1.4%、1.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验取供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h 进样，测得原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯色谱峰峰面积RSD分别为1.9%、1.7%、1.4%、1.1%、1.9%、0.51%、1.3%、0.18%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验取同一批供试品6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯含量的RSD分别为1.3%、1.5%、1.8%、1.2%、0.79%、1.9%、0.81%、2.9%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验精密称定同一批骨炎消方浸膏粉粉末6 份，各约1 g，分别精密加入混合对照品溶液（原儿茶酸1.1005 mg·mL－1、绿原酸0.9546 mg·mL－1、原儿茶醛0.4112 mg·mL－1、咖啡酸0.1708 mg·mL－1、表儿茶素0.1597 mg·mL－1、柚皮苷0.9963 mg·mL－1、淫羊藿苷0.8225 mg·mL－1、茴芹内酯0.1224 mg·mL－1）各1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果8 种成分的平均回收率在97.4%～100.4%，RSD在0.72%～2.9%，符合方法学要求。

2.4.6 样品的含量测定按“2.3”项下方法制备6批供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，记录各成分的峰面积，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(mg·g－1，n ＝6)Tab 2 Content determination of various constituent (mg·g－1，n ＝6)

根据《中国药典》2020年版一部[10]相关药材质量标准与6 批药材测得结果，暂定每1 g 骨炎消方浸膏中含原儿茶酸不少于1.15 mg、绿原酸不少于0.95 mg、原儿茶醛不少于0.38 mg、咖啡酸不少于0.15 mg、表儿茶素不少于0.15 mg、柚皮苷不少于0.95 mg、淫羊藿苷不少于0.68 mg、茴芹内酯不少于0.085 mg。

3 讨论

3.1 指标成分的确定

骨炎消方为民间收集的验方，对其研究主要集中在临床应用[8-9]及单味药材的报道[11-17]，尚未建立质量控制标准。骨炎消方中狗脊、杜仲、伸筋草、蜘蛛香、黑骨藤含有的苯丙素类（绿原酸、咖啡酸）和酚类化合物（原儿茶酸、原儿茶醛）具有抗炎、抗风湿、镇痛作用[11，14，18-21]；大血藤、透骨香具有良好的抗炎、止血、镇痛作用，其主要活性成分为绿原酸[22-24]；鸡血藤中主要药效成分为黄酮类（表儿茶素），具有抗关节炎、改善血液循环等药理作用[25]。骨碎补指标成分柚皮苷有抗炎、改善骨代谢作用，可促进成骨细胞增殖分化[26]；淫羊藿中的淫羊藿苷可调节骨代谢平衡以增强骨密度及强度，同时可促进微血管修复以改善股骨头局部血供[27]；飞龙掌血中丰富的香豆素类（茴芹内酯）成分对风湿性关节痛、出血等有良好的治疗作用[28]。结合骨炎消方临床上主要用于治疗骨性关节炎、类风湿关节炎、股骨头坏死等疾病，因此，选取原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、表儿茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹内酯作为指标成分。

3.2 色谱条件优化

本研究考察了甲醇-0.1%磷酸-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-水的流动相体系及25℃、28℃和30℃三个柱温，当流动相为乙腈-0.1%磷酸水，柱温为28℃时，分离度好，峰形好，基线稳定。比较了30%甲醇、60%甲醇、90%甲醇和甲醇的提取效果，结果甲醇提取效率高，杂质干扰小，峰形良好。研究了检测波长为210 nm、254 nm、270 nm和310 nm 的色谱峰情况，当波长为270 nm 时色谱峰分离情况良好，基线较平稳。