盐酸左氧氟沙星缓释片的制备及药物释放影响因素的考察

郑红，宋立倩，房东阳（乐普制药科技有限公司，浙江 台州 318000）

左氧氟沙星（Levo）是第三代氟喹诺酮类抗菌药物，它是氧氟沙星的L型-光学活性异构体，Levo 的抑菌活性是外旋体的2 倍，是其右旋体的8 ～128 倍[1]。与氧氟沙星相比，Levo 对需氧的革兰氏阳性球菌抑菌活性更强，对非典型病原体作用更强，且口服后吸收速度快，在全身组织均有分布，具有较高的生物利用度，作用更加长效，用药安全性高[2]。其作用机制是通过抑制细菌DNA 旋转酶的活性，阻止细菌DNA 的合成和复制而导致细菌死亡[3]。Levo 适用于敏感菌感染，对较深部位的感染疗效更好。在临床上，Levo 主要用于治疗呼吸、泌尿、生殖系统及皮肤软组织等轻至重度感染[4]。目前，国内市场上市的Levo 制剂主要有注射剂、片剂和胶囊剂，暂无市售的缓控释制剂。另外，Levo 是一种浓度依赖性抗菌药物[5]，其对各类细菌的最低抑菌浓度（MIC）值均较低[6]，革兰氏阳性菌的MIC在0.06 ～64 mg·L－1，革兰氏阴性菌的MIC在0.05 ～16 mg·L－1。

缓释制剂相比普通制剂，可以有效控制药物释放，更长时间维持Levo 的有效浓度，延长药物与细菌的接触时间，更好的发挥药效；并明显减少每日服药次数，增强患者的顺应性；而普通制剂因不能控制药物释放在释药过程中容易产生较大的血药浓度波动—— “峰谷”效应，引起患者的不良反应，严重者甚至可能死亡[7]。因此，将Levo 制备成缓释片可以使血药浓度更加平稳，增强Levo 在临床使用中的耐受性、安全性及顺应性。

因此，本实验选择盐酸左氧氟沙星（Levo-HCl）为模型药物，以羟丙甲基纤维素（HPMC）、乙基纤维素（EC）、微晶纤维素（MCC）、乳糖（Lac）为主要辅料，制备Levo-HCl 缓释片。在临床，根据患者的体质，成人患者的Levo-HCl片每日用量在300 ～600 mg，因此本文拟制备剂量为300 mg 的Levo-HCl 缓释片。

1 材料

1.1 仪器

FB7015 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TDP 型单冲压片机（上海天翔健台制药机械有限公司）；RC-8DS 型药物溶出度测定仪（天津市国铭医药设备有限公司）；UV-9100 型紫外-可见分光光度计（上海元析分析仪器公司）；LC-100 高效液相色谱仪（辉世仪器设备有限公司）。

1.2 试药

环丙沙星对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：99%，批号：130451-201904）；盐酸左氧氟沙星原料药（质量分数：99.8%，郑州艾克姆有限公司）；盐酸左氧氟沙星片（广东彼迪药业有限公司同，规格：100 mg/片，批号：20180512）；Levo-HCl 缓释片（自制）；HPMC、EC（上海卡乐康公司）；MCC（郑州艾克姆有限公司）；Lac（天津市大茂试剂厂）；硬脂酸镁（天津市大茂试剂厂）。

2 方法

2.1 Levo-HCl 释放度测定

按照《中国药典》2020年版通则0931 第一法释放度测定法，取6 片自制Levo-HCl 缓释片，溶出温度控制为（37.0±0.5）℃，转速为50 r·min－1，溶出介质为900 mL 盐酸溶液。在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 分别取溶液5 mL，并即时补充恒温溶出介质5 mL，用0.45 µm 微孔滤膜过滤，取续滤液稀释适当倍数，利用紫外-可见分光光度法，在294 nm 的波长处测定样品吸光度，计算释放度。

2.2 Levo-HCl 缓释片的制备

按处方量称取Levo-HCl（过100 目筛）、HPMC（过80 目筛）、EC（过80 目筛）、MCC（过80 目筛）、Lac（过80 目筛）并充分混合30 min，加入黏合剂（60%乙醇水溶液）适量，制备软材，过20 目筛，所制成的湿颗粒于40℃烘箱中干燥2 h，过20 目筛整粒，再加入硬脂酸镁适量，充分混合30 min。分别称取500 mg 混合物料进行压片，得到片剂，调整片剂的硬度在6 ～8 kg，片重为490 ～500 mg。

2.3 单因素考察

2.3.1 不同种类的HPMC 对药物释放的影响其他组分不变时，按表1中F1、F2、F3 处方进行称量，考察不同种类的HPMC（HPMC K4M、HPMC K15M、HPMC K100M）对片剂中药物释放的影响。

2.3.2 不同用量的HPMC 对药物释放的影响 其他组分不变时，按表1中F1、F4、F5 处方进行称量，考察不同用量的HPMC（含量分别是5%、15%、25%）对片剂中药物释放的影响。

2.3.3 不同用量的EC 对药物释放的影响 其他组分不变时，按表1中F4、F6、F7、F8 处方进行称量，考察不同用量的EC（含量分别是0%、5%、10%、15%）对片剂中药物释放的影响。

2.3.4 不同比例的MCC 与Lac 对药物释放的影响 其他组分不变时，按表1中F7、F9、F10处方进行称量，考察不同比例的MCC 与Lac（MCC 与Lac 比例分别是2∶1、1∶1、1∶2）对片剂中药物释放的影响。

表1 盐酸左氧氟沙星缓释片处方(%)Tab 1 Formulation of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets (%)

2.4 正交设计法优化处方工艺

在单因素考察的基础上，将影响Levo-HCl缓释片释放行为的关键因素，利用正交实验表[8]，以自制缓释片与一级动力学释放行为拟合的相关系数（r2）（n＝6）作为评价指标，评价处方的优劣。

2.5 最优处方重现性考察

按照最优处方工艺制备3 批Levo-HCl 缓释片，对片剂的外观、机械性质分别进行测定；按照“2.1”项下方法测定片剂中药物的体外释放度，并将释放度与一级动力学的相关系数作为评价指标，采用相似因子ƒ2法对3 批自制制剂进行批间相似性评价，以考察处方、工艺的重现性和稳定性。

2.6 Beagle 犬体内药物动力学研究

2.6.1 样品的采集 采用双周期交叉给药的实验方案，将8 只健康Beagle 犬作为受试的实验动物。禁食12 h 后给药，随机分为两组，空腹抽取空白血4 mL。其中参比制剂为市售普通片，每次给药3 片（每片100 mg，以C18H20FN3O4计）；受试制剂为自制缓释片，每次给药一片（每片300 mg，以C18H20FN3O4计），均用50 mL 温开水送服。服药4 h 后统一给食并自由饮水，分别于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h 于前肢静脉取血3 mL 置肝素抗凝管内，3500 r·min－1离心15 min。取上层血浆，将样品放置于－20 ℃冰箱中冷冻保存备用。

2.6.2 血浆样品的处理与测定 用1.5 mL 离心管精密称取空白血浆0.45 mL，精密加入质量浓度 为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0µg·mL－1的Levo-HCl 溶液（精密称取Levo-HCl适量，将样品倒于100 mL 棕色量瓶中，用HCl溶解并稀释至刻度，摇匀，即得）50 µL。加入环丙沙星内标溶液（精密称取环丙沙星对照品约30 mg，将样品倒于50 mL 棕色量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀即得）50 µL，涡旋混匀后加入5%的高氯酸0.5 mL，涡旋1 min，离心2 次，转速为12 000 r·min－1，每次10 min，取上清液20 µL，进样测定，记录样品的色谱图和峰面积[9]。质量浓度C为横坐标，主药与内标的峰面积比S为纵坐标，线性拟合得回归方程S＝0.0586C＋0.0021，r2＝0.9908，线性范围为0.25 ～32.0 µg·mL－1。以S/N＝10 计算，定量限为40 µg·mL－1。

用1.5 mL 离心管精密称取含药血浆0.5 mL，按“2.6.2”项下方法操作，记录样品的色谱图，计算各时间点的血药浓度，并用DAS 2.0 软件程序计算药动学参数。

3 结果

3.1 HPMC 种类对药物释放的影响

选择不同种类的HPMC 制备片剂，其累计释放情况见图1。

图1 HPMC 种类对药物释放的影响（n ＝6）Fig 1 Effect of types of HPMC on drug release（n ＝6）

由图1可见，不同种类的HPMC 对药物释放速度的影响十分显著，不同种类的HPMC 对于片剂的缓释效果排名如下：HPMC K100M ＞HPMC K15M ＞HPMC K4M。这是因为不同型号的HPMC 黏度不同，随着HPMC 黏度的增大，吸水后形成的凝胶层强度增大，凝胶层的骨架溶蚀速率减慢，药物释放速度明显下降，实验结果与相关文献报道的结果一致[10]。另外，在释放的初期（前2 h），3 种缓释材料所呈现的释放曲线行为极为相似，推测与药物溶解度较大与没有充足的时间形成凝胶骨架有关。另外，片剂在2 h时释放大于50%，推测产生“突释”现象与药物具有良好的溶解度有关。综合考虑，选择在处方中加入HPMC K100M 作为缓释材料。

3.2 不同用量的HPMC K100M 对药物释放的影响

选择不同用量的HPMC K100M 制备片剂，其累计释放结果见图2。由图2可见，不同用量的HPMC K100M 对于药物释放速率有明显的影响，HPMC K100M 用量越多，片剂吸水后形成的凝胶层越厚，强度越大，骨架的溶蚀速率越慢，药物释放速度越慢。当HPMC 含量为5%时，药物在8 h 释放超过90%，药物释放过快；当HPMC 含量为25%时，药物在12 h 时释放80%，药物释放不完全，而且后期释放速度明显下降，药物无法完全释放。综合考虑，选择在处方中加入15%的HPMC K100M。

图2 不同HPMC K100M 含量对药物释放的影响（n ＝6）Fig 2 Effect of different amounts of HPMC K100M on the drug release（n ＝6）

3.3 不同用量的EC 对药物的释放的影响

选择不同用量的EC 制备片剂，其累计释放结果见图3。由图3可知，不同用量的EC 对于药物释放有显著的影响。EC 在处方中的作用是减少孔道形成。当不加EC 时，药物释放的最快，随着EC 的用量增多，由HPMC K100M 形成的凝胶层的孔道变少，药物的释放减缓。当EC 含量为10%和15%时，片剂的溶出曲线相似，证明EC 超过10%时，对于片剂的释放影响极小。综合考虑，在处方中EC 的含量为10%。

图3 不同EC 含量对药物释放的影响（n ＝6）Fig 3 Effect of different amounts of EC on the drug release（n ＝6）

3.4 不同比例的MCC 与Lac 对药物释放的影响

选择不同比例的MCC 与Lac 制备片剂，其累计释放结果见图4。由图4可知，MCC 与Lac在处方中起到填充剂的作用，MCC 与Lac 比例的改变对于片剂的释放影响不大，仅有细微差距。综合考虑，选择填充剂MCC 与Lac 的比例为1∶1。

图4 不同MCC 与Lac 比例对药物释放的影响（n ＝6）Fig 4 Effect of different ratio of MCC∶Lac on the drug release（n＝6）

3.5 正交实验结果

根据单因素考察结果，HPMC 种类和用量、EC 用量对释放影响较大。最终选择HPMC K100M 用量（A）、EC 用量（B）两个关键因素进行正交实验设计，按照正交设计表进行实验（见表2），进行两因素三水平正交实验，结果见表3。

表2 盐酸左氧氟沙星缓释片正交实验因素水平表Tab 2 Factor and level of orthogonal experimental for levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets

表3 正交实验分析结果(n ＝6)Tab 3 Orthogonal experimental design (n ＝6)

通过极差分析结果可知，两种因素对体外药物累计释放的影响大小排序为：A ＞B，主要是因为HPMC K100M 是一种水溶性材料并且黏度较大，是缓释片形成凝胶骨架的主要材料，HPMC K100M 的用量直接决定着凝胶层的厚度与强度，控制药物的释放。而EC 是一种不溶于水的材料，对于片剂起到调节释放的作用，主要通过控制扩散路径的多少、大小进而改变药物的释放速率，EC 的用量对于药物的释放具有一定的影响。通过直观分析法对实验结果进行处理，得到最优处方组成为A2B3，即HPMC K100M 的处方用量为15%，EC 的处方用量为10%。

3.6 最优处方、工艺重现性考察

基于正交设计实验得到的最优化处方为Levo-HCl 60%，HPMC K100M 15%，EC 10%，MCC 7.5%，Lac 7.5%。以最优处方为基础，制备3 批Levo-HCl 缓释片，所制备的片剂外观光泽，表面规整，机械性能（包括硬度、脆碎度）符合药典规定，片剂的含量差异性较小，符合固体制剂相关要求。

将3 批自制缓释片进行体外释放度实验，结果见图5。采用ƒ2相似因子法对3 批自制制剂进行批间相似性评价，结果见表4。3 批自制Levo-HCl 缓释片的体外释放曲线相似性良好，f2均大于50。3 批自制片在0 ～12 h 内药物呈现缓慢释放的趋势，证明所得到的优化处方合理可靠，工艺稳定，重现性良好。

图5 最优处方3 批制剂体外释放曲线（n ＝6）Fig 5 Release profile of 3 batches of optimized formulation（n ＝6）

表4 最优处方3 批制剂体外释放ƒ2 (n ＝6)Tab 4 ƒ2 of 3 batches of optimized formulation (n ＝6)

3.7 Levo-HCl 缓释片在Beagle 犬体内药动学研究

3.7.1 药动学参数及计算 将平均血药浓度（C）对时间（t）作图，结果如图6所示；采用DAS 2.0 药物动力学软件对不同时间点的血药浓度数据进行非隔室模型拟合，计算主要药动学参数，结果如表5所示。

图6 Levo-HCl 缓释片平均血药浓度-时间曲线（n ＝8）Fig 6 Mean plasma concentration-time curve of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet（n ＝8）

表5 Levo-HCl 缓释片主要药动学参数(x ±s，n ＝8)Tab 5 Main pharmacokinetic parameters of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet (x ±s，n ＝8)

3.7.2 体内外实验相关性评价 生物利用度是考察药物制剂质量是否合格的重要指标之一，但生物利用度的测定要求较高，常需要在人体内进行实验研究，无法作为一般产品的质量控制手段。而体外释放在很大程度上可以反映药物在体内吸收情况，但需证明其合理性，即体外释放度与生物利用度具有良好的相关性。根据查阅相关文献可知[11-12]，可以通过拟合处理体外累计释放度与体内吸收分数（Fa）得到两者相关性。

体内吸收分数主要根据给予某种制剂后测定血药浓度-时间的数据得到（见表6），根据Wagner-Nelson 方程计算，公式如下：

表6 盐酸左氧氟沙星缓释制剂的血药浓度(x±s，n ＝8)Tab 6 Plasma concentration of levofloxacin hydrochloride sustained-release preparation (x±s，n ＝8)

Fa＝（Ci＋KeAUC0→t）/KeAUC0→∞×100%

其中Ci为t时间下的血药浓度；Ke为消除速率常数。

采用表7中自制缓释片体外释放百分率（Fr）与Fa进行线性回归，可得回归方程为Fa＝1.1106F＋0.1397（R²＝0.9906），结果表明F与Fa具有良好的相关性，体外释放度可以在一定程度上反映药物在体内的吸收情况。

表7 盐酸左氧氟沙星缓释制剂药物释放体内外相关性Tab 7 Drug release of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets in vitro and in vivo

3.7.3 相对生物利用度计算 以非隔室模型统计结果中的AUC0→t数据，计算与参比制剂同剂量的Levo-HCl 缓释片的相对生物利用度（F）。

相对生物利用度计算公式如下[13]：

F＝[AUC0→t（T）/DT]/[AUC0→t（R）/DR]×100%

其中，T、R 分别代表受试片和参比缓释片。

经计算可知，自制Levo-HCl 缓释片对市售片Beagle 犬体内的平均相对生物利用度为91.61%。

4 结论

本文的模型药物为Levo-HCl，通过正交设计制备具有良好缓释能力的凝胶骨架片。采用单因素实验确定了影响药物释放的重要因素，并以自制片与一级动力学释放行为的相关系数作为评价指标，采用正交实验设计对处方工艺进行优化，最佳处方组成为Levo-HCl 60%、HPMC K100M 15%、EC 10%、MCC 7.5%、Lac 7.5%。最终自制Levo-HCl 缓释片在12 h 内呈现一级药动学释放特征，可降低血药浓度波动。同时自制片在Beagle 犬的药动学研究结果表明，自制Levo-HCl缓释片与市售普通片相比，具有缓释效果，相对生物利用度为91.61%。