农杆菌介导5种中草药叶片瞬时表达的研究

孙 敏，达晓伟，张悦婧，李 颖，庞海龙, 2，冯汉青, 2*

(1西北师范大学 生命科学学院，兰州 730070；2西北师范大学 新农村发展研究院，兰州 730070)

农杆菌介导法、 花粉管通道法、基因枪法、微注射法、电激法、化学法(PEG、PLD、DVA)等技术广泛应用于转基因研究中，其中农杆菌介导法使用最为广泛[1-2]。农杆菌介导法的原理是将目的基因克隆到经改造后的T-DNA上，构建重组载体系统，并转化到农杆菌宿主中，然后用农杆菌侵染植物伤口，从而将携带目的基因的T-DNA转入到植物细胞中进行表达。通过上述方法，外源基因可通过稳定表达或瞬时表达在植物中产生蛋白产物。但稳定转化涉及到遗传和筛选鉴定等，因此是需要持续几个月到一年。相比而言，农杆菌介导的瞬时表达虽然使得大部分T-DNA并未整合入宿主基因组内，但可以短时间暂存于细胞核中，从而在数天内快速表达外源基因[3-4]。该技术具有成本效益、周期短、坚固、安全性高、高通量、转化效率高的优势，可以在几天内观察到实验处理的结果，因此在分析植物中基因功能、基因启动子和抑制子特性、转录因子活性、蛋白质亚细胞定位和蛋白质间相互作用[5-7]等方面具有极大的便利。

中国中草药(Chinese herbal medicine,CHM)种植面积广阔，生产量高，其大部分取根或根茎入药，广泛用于治疗和预防各种疾病[8-11]。并且中草药植物中的一些次生代谢物质已被认可用于食品、药品、化妆品、茶或咖啡的替代品或植物胶的来源[12]。因此，对于中草药的研究目前需要有效的基因功能的分析方法来帮助揭示中草药代谢物产生、有效成分积累、生长规律和机制等。但中草药多为多年生植物，利用稳定转化需要耗费大量时间。如果利用农杆菌介导法将外源基因导入中草药中实现瞬时表达，对于提高中草药研究具有重要意义。

农杆菌属通过叶浸润介导的瞬时表达的方法已广泛用于多种植物，包括烟草、莴苣、番茄、菜豆和拟南芥等[13-16]，而中草药适合用于农杆菌介导的瞬时表达方法尚不清楚，其相关影响因素也无研究。基于以上原因，本研究选用两种常见的非病毒型(载体Ⅰ)和病毒型二元载体(载体Ⅱ)[17-18]，两种农杆菌(EHA105和LBA4404)[19-20]，以常见的中草药(甘草、黄芩、大黄、板蓝根和黄芪)植株为材料，以报告基因GFP为表征手段[21-22]，以烟草瞬时表达为参照，以无转化载体的农杆菌为对照，采用农杆菌介导的瞬时表达对以上5种中草药叶片注射侵染。通过徕卡荧光体式镜检测5种中草药叶片中绿色荧光蛋白的瞬时表达情况，对未来在中药材中瞬时表达技术的应用奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本氏烟草(Nicotianabenthamiana)种子由本实验室收集并常温保存，甘草[23](GlycyrrhizauralensisFisch.)、黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、蒙古黄芪[24][Astragalusmembranaceusvar.mongholicus(Bge.) Hsiao]、大黄(RheumofficinaleBaill.)和板蓝根(IsatistinctoriaL.)购自中国河北中药材种植有限公司，5种中草药种子在-4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 材料处理

本氏烟草种子通过育苗盘培养在育苗块上，每个育苗盘中放有10个育苗块，加蒸馏水浸润后点种，将育苗盘加盖并置于25 ℃、50%湿度的培养室中，以16 h/8 h昼夜周期生长2周左右，当幼苗长出3～4个叶片后去盖并转移至空间较大的托盘中，培养至苗龄5～6周时进行瞬时侵染。

实验前期取出5种中草药种子分别进行灭菌处理：甘草和黄芪，80%浓硫酸处理种子3 min，流水冲洗30 min，甘草浸泡6 h，黄芪浸泡12 h；黄芩于30 ℃温水浸泡5～6 h；板蓝根于30 ℃温水浸泡10 h；大黄于1%的次氯酸钠杀菌消毒10 min，蒸馏水冲洗3～5次。之后置于垫双层纱布的培养皿中，于23 ℃培养箱中进行种子萌发：甘草和黄芪2～3 d，板蓝根3～4 d，黄芩和大黄6～7 d。种子出芽2～3 cm后移栽到装有营养土的小花盆中，常温培养室中培养5～6周用于瞬时侵染。

1.3 方 法

1.3.1 细菌菌株和载体及重悬液的制备非病毒型二元载体由瓦格宁根大学Klaas Bouwmeester教授提供；病毒型二元载体由亚利桑那州立大学Hugh S. Mason教授提供。将带有GFP的非病毒型和病毒型二元载体分别转化2种农杆菌(EHA105和LBA4404)菌株。将新鲜农杆菌从-80 ℃甘油储备中接种活化，在含50 mg·L-1卡那霉素(Kanna)、25 mg·L-1利福平(Rif)、25 mg·L-1氯霉素(Chl)的YEB琼脂平板上划线接种，于28 ℃下静止生长24～48 h,挑取单菌落接种于含相同抗生素单YEB液体培养基中。用同样处理无转化载体的空菌(EHA105和LBA4404)作对照组。于28 ℃、180 r·min-1条件下摇床培养16～19 h后，取出菌液移至4 mL离心管中，4 ℃、5 000 r·min-1离心10 min后弃上清收集菌液。配置重悬溶液(10 mmol·L-1MgSO4， 10 mmol·L-1MES-KOH，100 μmol·L-1乙酰丁香醇，dd H2O加至100 mL，pH 5.5)，清洗并重悬菌体，使重悬后的OD600为0.8，室温放置3 h后用于叶片侵染。

1.3.2 叶片侵染及GFP的检测选取叶片舒展、大小、长势基本一致的5种中草药(甘草、黄芩、大黄、板蓝根、黄芪)叶片和烟草叶片，用针头轻刺注射叶片的下表皮，将悬浮液用5 mL无菌注射器缓慢渗入叶片气缝中，每种植株选取3～5个叶片进行完全注射侵染，重复3次实验。经注射后的植株继续在培养室中培养。注射后第2～7天用徕卡荧光体式镜(Leica Microsystems Ltd.DFC450C)检测烟草叶片荧光表达量及中草药叶片荧光，即绿色荧光蛋白的表达情况并拍照记录。

1.3.3 烟草叶片荧光的定量分析采用ImageJ软件分析GFP在烟草叶片中绿色荧光表达图片，所得数值至少为3次独立实验的平均值，实验结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析并用Excel 2010作图，以P<0.05表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 载体转化及烟草叶片侵染

本实验为了保证载体成功转入农杆菌，从农杆菌中提取Ti质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳对2种表达载体进行电泳检测(图1);农杆菌从-80 ℃甘油储备中划线接种在含筛选抗生素的YEB培养基上，次日后长出菌落(图2)；农杆菌介导烟草叶片侵染使用无菌无针注射器来引入农杆菌进入烟草叶片(图3)。首先，准备材料并吸取2 mL农杆菌重悬液(图3，A、B),其次通过轻轻地刮擦而不刺穿两侧，在叶背面的表皮上用针刺出一个小缺口(图3，C)。最后使用无针注射器将浸润在培养基中的农杆菌通过缺口注入叶片中。当农杆菌混合物进入叶片的细胞间空间时，浅绿色开始变暗，表明已成功渗透(图3，D)。

M.Marker; 1、2. 载体Ⅰ；3. 载体Ⅱ图1 质粒凝胶电泳图M. Marker; 1, 2. CarrierⅠ; 3. The carrier ⅡFig.1 Plasmid gel electrophoresis

A、D. 无转化载体的EHA105、LBA4404；B、E. 携带载体Ⅰ的EHA105、LBA4404; C、F. 携带载体Ⅱ的EHA105、LBA4404图2 农杆菌在YEB上的培养性状A, D. EHA105 and LBA4404 without transformation carrier; B, E. EHA105 and LBA4404 carrying carrierⅠ; C, F. EHA105 and LBA4404 carrying carrierⅡFig.2 Culture traits of Agrobacterium tumefaciens on YEB

A. 材料准备：5周龄烟草、农杆菌重悬液、无菌注射器；B. 无菌注射器吸取2 mL农杆菌重悬液；C. 针头轻刺烟草叶片背面；D.通过缺口将菌液注射到叶片间隙中图3 农杆菌对烟草叶片的注射器浸润A. Preparation materials: 5-week-old tobacco, Agrobacterium resuspension, sterile syringes; B. Draw 2 mL Agrobacterium resuspension from sterile syringe; C. Gently prick the back of the tobacco leaf with the needle; D. Inject bacterial fluid into the leaf space through the gapFig.3 Agrobacterium tumefaciens infiltration in syringes on tobacco leaves

烟草是外源基因瞬时表达的首选植物，目前已在多个方面优化条件，以提高蛋白质的表达量。将带有GFP的2种农杆菌(EHA105和LBA4404)菌株侵染烟草叶片，在OD600为0.8，侵染2～4 d后，结果显示：烟草叶片中均能瞬时表达GFP(图4)。与无荧光表达的对照组相比，携带载体Ⅱ的LBA4404菌株GFP荧光表达量很高，瞬时转化效率最高；携带载体 Ⅰ的EHA105菌株荧光表达量高，转化效率好；含载体Ⅱ的EHA105菌株和含载体Ⅰ的LBA4404菌株荧光蛋白表达相近，并且含载体Ⅰ的LBA4404菌株瞬时转化效率最低(图4，表1)。进一步证明了2种农杆菌在烟草叶片中成功瞬时表达绿色荧光蛋白，为在中草药叶片中能否瞬时表达GFP奠定基础。

A. 比例尺=2 mm Scale =2 mm图4 农杆菌介导烟草叶片GFP荧光表达Fig.4 GFP fluorescence expression in tobacco leaves mediated by Agrobacterium tumefaciens

表1 不同菌株及载体在烟草叶片中GFP荧光表达量

2.2 携带两种常见二元载体的农杆菌EHA105和LBA4404介导5种中草药叶片的瞬时表达

分别用载体Ⅰ和载体Ⅱ转化的EHA105菌液侵染5种中草药叶片。结果如图5、表2所示，相比对照组，携带载体Ⅰ的EHA105菌株在中草药植株中转化效率更高，其中在甘草叶片中荧光强度最高，大黄叶片中较高，黄芩、黄芪和板蓝根中很低，且黄芪只在伤口处检测到荧光，并未向四周扩散表达。携带载体Ⅱ的EHA105菌株仅在甘草叶片的注射孔处瞬时表达荧光蛋白，其他4种中草药中未检测到绿色荧光，即GFP未表达。

0-EHA105.无转化载体的EHA105；Ⅰ-EHA105. 携带载体Ⅰ的 EHA105; Ⅱ-EHA105. 携带载体Ⅱ的EHA105; 标尺=2 mm图5 农杆菌EHA105介导5种中草药叶片GFP荧光表达0-EHA105. EHA105 without transformation vector; Ⅰ-EHA105. EHA105 carrying vector Ⅰ; Ⅱ-EHA105. EHA105 carrying vector Ⅱ; Scale = 2 mmFig.5 Agrobacterium tumefaciens EHA105 mediated GFP fluorescence expression in the leaves of five Chinese herbal medicines

表2 不同菌株及载体在5种中草药叶片中的GFP荧光表达量

如图6、表2所示，与对照组相比，LBA4404菌株在甘草叶片的伤口处及周围表达GFP，并没有EHA105菌株转化效率高；携带载体Ⅱ的LBA4404在烟草叶片中瞬时蛋白表达量很高，同样，在黄芩叶片中GFP有很高的蛋白表达量。相反，携带载体Ⅰ的LBA4404菌株在黄芩叶片中未检测到绿色荧光。黄芪叶片中检测出弱荧光，GFP荧光表达量较低；LBA4404菌液侵染的大黄和板蓝根叶片中几乎无绿色荧光。

0-LBA4404.无转化载体的LBA4404; Ⅰ-LBA4404. 携带载体Ⅰ的 LBA4404;Ⅱ-LBA4404. 携带载体Ⅱ的 LBA4404; 比例尺=2 mm图6 农杆菌LBA4404介导5种中草药叶片GFP荧光表达0-LBA4404. LBA4404 without transformation vector;Ⅰ-LBA4404. LBA4404 carrying vector Ⅰ; Ⅱ-LBA4404. LBA4404 carrying vector Ⅱ; Scale =2 mmFig.6 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediated GFP fluorescence expression in the leaves of five Chinese herbs

3 讨 论

植物瞬时表达是一种可以在短时间内高效表达目标基因的技术，这是一种检测靶基因功能的简单、快速、有效的方法。对于难以发展遗传转化系统的物种，瞬时表达系统的构建具有重要意义[25]。研究表明，重组质粒进入植物细胞后，目标基因可以在12 h内表达，并且会在2～4 d内表达水平达到峰值[26]。也有报道GFP在植物组织中连续表达3 d到达峰值，明显表达需要至少1周[20]。刘文浩等[21]发现，菌液浓度OD600为0.4左右，侵染48 h后，烟草叶片中外源蛋白的表达效率最高。Zhang等[27]发现农杆菌浸润溶液OD600为0.5，拟南芥叶片共培养3～4 d明显瞬时表达GFP。而本研究结果发现，菌悬液OD600为0.8，农杆菌侵染烟草叶片2～3 dGFP瞬时转化率均高，而中草药叶片中需要侵染5～7 d，才能检测到高水平表达的绿色荧光蛋白，特别是甘草和黄芩叶片。这表明不同的植物、菌液浓度和侵染时间对农杆菌介导的基因瞬时表达的敏感性表现出很大的差异性[28]。因此，需要根据实验条件、预期结果和所用材料进行条件优化，从而提高瞬时转化效率。

农杆菌通过涉及农杆菌Vir蛋白和宿主蛋白的T-DNA传输机制将位于Ti质粒左边界(LB)和右边界(RB)之间的基因传递到植物组织中，因此瞬时转化的效率受多种因素影响，例如：共培养条件、农杆菌品系、二元载体类型、寄主植物种类、外植体来源、组织培养基等[25]。主要表现为不同的农杆菌对植物亲和力及感染力的差异性。Andrieu等[29]发现EHA105菌株在水稻叶片中的瞬时表达效果优于LBA4404。本研究结果显示，整体而言EHA105菌株对中草药叶片感染效果优于LBA4404，携带非病毒型载体的EHA105在甘草和大黄叶片中实现了绿色荧光蛋白的瞬时表达，而黄芪、板蓝根叶片中荧光强度较低或几乎无GFP表达。此外，据报道EHA105和LBA4404菌株感染豆类具有高表达效率[13,30]，Withania somnifera等[4]发现LBA4404菌株具有最高的感染效果，本实验中携带病毒载体的LBA4404菌株在黄芩叶片中实现GFP高水平的瞬时表达，甘草叶片在注射孔及周围检测到较高的荧光强度。这进一步说明农杆菌菌株的遗传背景和修饰的Ti质粒组合明显影响细菌宿主范围和各种植物物种的转化效率。本研究在中草药叶片中成功建立瞬时表达体系，为后期在中药材中分析功能基因、抗体、疫苗和大规模生产药用蛋白提供了理论依据。

与中草药中无转化载体的菌株及烟草瞬时表达相比，农杆菌介导的中草药叶片的瞬时表达效率较低，依据农杆菌与植物先天免疫反应[31-32]，本研究推测一方面中草药对农杆菌的先天免疫应答更为敏感，表现为对外源基因的表达具有抗性，甚至有抑菌现象。虽然目前还不清楚具体原因，但已有研究数据表明，一些植物激素和酸诱导性基因在某些植物体内对农杆菌的转化具有抵抗力，特别是植物激素的平衡会影响农杆菌的瞬时转化效率，表现为促进或抑制基因的表达、细菌的生长，进而来影响农杆菌的感染过程[28]。另一方面从表型上更加直观地推测，瞬时转化效率受叶片面积、叶脉、苗龄和叶片厚度等影响，5～6周龄烟草叶片大且容易注射侵染，而侵染4 d后在农杆菌浸润区域叶片出现萎黄、变软变烂现象，潜在机制尚未得到很好地解释，可能与叶脉少、叶片薄及叶绿体对农杆菌的防御反应有关。然而5～6周龄中草药叶片难以注射菌液，这可能是由于叶片面积小，叶脉多及狭窄的细胞间隙使菌液难以渗入，并且成熟叶片表面存在厚厚的角质层和蜡涂层所致[5,33]。因此，在小叶片上出现2～3处伤口，后续研究可考虑真空渗透[34]。此外，由于5种中草药叶片面积不同及出现了仅在注射孔处检测到的荧光强度反而高于整个叶片的荧光蛋白表达情况，因而本研究以烟草为参照对中草药叶片中GFP的荧光表达量进行定性分析，后续研究有待进一步定量分析并提高中草药叶片中外源基因瞬时转化效率。

中草药植物大部分取根入药，其叶等地上器官通常被遗弃，然而研究证明，许多药用植物地上部分也具有多种有效活性成分[35-36]。因此，以中草药叶片为生物反应器，通过农杆菌介导的瞬时表达技术，将外源基因瞬时且高水平表达，提高了药用植物叶片等地上部分的利用效率。农杆菌介导的瞬时转化成为研究植物基因的最佳选择，尤其在2021年国家进一步鼓励农业转基因生物原始创新的背景下，以农杆菌介导的瞬时转化有望作为中草药品种创新的有力工具，为国家的中药材事业发展提供支撑。