基于免疫组织化学、组织芯片和RNA测序数据分析MACC1在结直肠癌的临床病理学意义

吴共发，邱丽浈，刘海盛，曾宇婷，黄绮亭，曾炼坤，徐润强，李海刚,6*

（广州医科大学附属第四医院1病理科，2健康管理中心，3麻醉科，4内三科，5普外科，广州 511300；6中山大学孙逸仙纪念医院病理科，广州 510120）

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是全世界病死率居第3位的恶性肿瘤[1]。在我国，CRC发病率逐年提高，已居恶性肿瘤第3位[2]。迄今CRC的治疗以外科手术为主，结合放化疗及靶向治疗等方法，但其根治术的5年生存率仅约50%，侵袭和转移仍是死亡的主要原因[1]。因此，利用生物大数据发现并研究与CRC关系密切的新型分子标志物，对于提高疾病早期诊断、患者生存率及临床治疗效果具有重要的现实意义。结肠癌转移相关基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1）是2009年被证实的一个与CRC转移密切相关的基因[3]，有望为CRC分子靶向治疗提供新靶点。目前国内外针对MACC1在CRC中的相关研究均有报道，但MACC1在CRC发生、发展以及作为治疗靶点的相关机制尚未完全阐明。Human Protein Atlas(HPA)数据库是一个巨大的基于RNA测序和免疫组化分析的转录组和蛋白质组数据库，在蛋白表达分析上具有重要价值[4]。Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)数据库是在肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA）与基因型-组织表达（the genotype-tissue expression，GTEx）这两大著名转录组数据库基础上建立的可视化癌症大数据分析平台[5]。本研究通过免疫组织化学检测CRC中的表达并结合挖掘HPA与GEPIA 两大数据库中相关信息，分析MACC1的蛋白和mRNA在CRC组织中的表达差异、与CRC发病密切相关分子的关系以及与临床病理特征分期和预后的关系，为进一步研究MACC1基因在CRC中的作用机制提供线索与思路。

材料与方法

1 临床资料

选取广州市增城区人民医院病理科库存的2015年3月至2017年12月手术切除的77例大肠癌及癌旁石蜡组织，均经过4%中性甲醛固定及石蜡包埋。所有病例均有完整的临床资料并且经过病理诊断证实。结直肠癌的病理诊断根据WHO消化系统肿瘤分类标准第5版，临床分期参照美国癌症联合会（AJCC）第八版分期。所有病例术前未经放化疗。

2 试剂

兔多克隆浓缩型抗体MACC1（ab106579）购自英国Abcam公司。即用快捷型免疫组织化学MaxVisionTMHRP (Mouse/Rabbit)检测试剂盒（KIT-5002）、柠檬酸盐抗原修复液、抗体稀释液、PBS缓冲液和DAB显色剂均购自福州迈新公司。

3 免疫组织化学

石蜡组织块4μm厚切片，防脱玻片捞片，烤箱70℃烤片30min，常规脱蜡至水后按免疫组化检测试剂盒说明书操作，采用柠檬酸盐修复液在高压锅热修复3min，自然冷却后PBS 漂洗5min×3，切片完全浸泡在医用双氧水中10min，PBS 漂洗5min×3；加入一抗（MACC1按1:1500稀释使用），37℃孵箱1h，PBS 漂洗5min×3，加入二抗，37℃孵箱20min，PBS漂洗5min×3； DAB 显色，显微镜下控色，自来水终止DAB，苏木素复染细胞核，70℃烤片30min，干片后中性树脂封固。PBS取代一抗作阴性对照，以人肝组织为阳性对照。免疫组织化学结果判断按照文献[6]。

4 HPA数据库分析

应用HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/）验证MACC1在结直肠癌中的免疫组织化学实验结果，本研究采用该数据库中的44例结直肠癌组织芯片的81个有效位点的MACC1表达情况。同时采用HPA数据库中分析基于579例结直肠癌组织的MACC1 mRNA表达水平与患者生存预后的关系。

5 GEPIA数据库分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大学研制开发的用于整合分析癌症表达谱数据的交互式web服务器，包含来自TCGA 和GTEx的33种恶性肿瘤9736个肿瘤样本和8587个正常样本的RNA测序表达数据[5]。在本研究中使用GEPIA数据库中的“Expression on Box Plots”模块验证之前免疫组化实验及HPA数据库所得出的相关结果，应用“Pathological Stage Plot”和“Survival Plots”模块进一步分析MACC1基因与CRC临床分期及生存预后之间的关系。然后通过“Correlation Analysis”模块阐明MACC1基因与CRC发生关系密切的错配修复基因表达的相关性。

6 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件，77例结直肠癌的免疫组化实验所得计量资料采用Pearson Chi-Square Test，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 结直肠癌组织高表达MACC1

MACC1免疫反应阳性产物表达于CRC组织的细胞质，部分癌细胞核也有表达，癌组织周围的纤维间质也可见阳性表达（图1），MACC1在CRC组织的阳性表达率75.32%（58/77）。MACC1在癌旁正常黏膜组织中大部分呈阴性表达，阳性表达率11.69%（9/77）。统计学分析显示MACC1在CRC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜（χ2=65.83,P=0.00）。

图1 免疫组织化学检测MACC1在结直肠癌中的表达。A，MACC1在正常肠黏膜呈阴性表达；B，MACC1在结直肠癌呈阳性表达，比例尺，50μmFig. 1 Immunohistochemical detection of the MACC1 expression in CRC. A, negative expression of MACC1 in adjacent normal mucosa; B, positive expression of MACC1 in CRC; scale bar, 50μm

2 MACC1与CRC临床病理特征的关系

对MACC1与CRC临床病理特征的关系分析显示（表1）：有淋巴结转移和无淋巴结转移病例癌组织中的MACC1阳性表达率分别为97.30%和55.00%，差异具有统计学意义（χ2=18.50,P=0.00）。在有神经侵犯和无神经侵犯病例癌组织中的MACC1阳性率为100%和60.42%，差异具有统计学意义（χ2=15.24,P=0.00）。临床分期Ⅲ期病例癌组织的MACC1阳性表达率为90%，明显高于Ⅰ期和Ⅱ期的60.00%和55.00%（χ2=20.11,P=0.00）。MACC1与患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小、浸润深度和肿瘤部位均无关（表1）。

表1 MACC1表达与结直肠癌临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between the MACC1 expression and the clinicopathological features of CRC

3 公共数据库中结直肠癌组织的MACC1表达

HPA数据库分析显示，44例结直肠癌组织芯片的81个有效位点的MACC强、中、弱阳性表达分别是25例、18例和1例（图2A）。GEPIA数据库显示275例结肠癌和92例直肠癌组织中的MACC1 mRNA水平均明显高于相应的正常肠黏膜组织（图2B）。

图2 不同公共数据库中MACC1在结直肠癌的表达。A，HPA数据库中MACC1在结直肠癌组织和正常组织中的表达。B, GEPIA数据库中MACC1 mRNA在MACC1在结直肠癌组织和正常组织中的表达； COAD，结肠癌；READ，直肠癌；*P<0.001Fig. 2 Expression data of MACC1 in CRC from different Public databases. A, expression data of MACC1 in CRC tissues and normal tissues from the HPA database. B, expression data of MACC1 mRNA in CRC tissues and normal tissues from the GEPIA database; COAD, colon cancer; READ, rectal cancer; *P<0.001

4 公共数据库中MACC1在结直肠癌临床分期和预后中的意义

在GEPIA中分析MACC1表达与结直肠癌临床病理分期的关系，显示在不同的肿瘤临床分期各组间MACC1 mRNA 表达差异具有统计学意义（F=3.29，P=0.0209）（图3A）。GEPIA数据库生存分析功能显示，MACC1高表达组的结直肠癌患者总生存率与无病生存率均明显低于低表达组（均0.01

图3 GEPIA数据库中MACC1与结直肠癌临床分期及患者预后的关系。A，GEPIA 数据库分析显示MACC1表达和结直肠癌患者临床分期密切相关(小提琴图，单向方差分析，0.01

图4 HPA数据库的生存分析显示低表达MACC1 mRNA的结直肠癌患者预后比高表达MACC1的患者好Fig. 4 Survival analysis with data from the HPA database indicated that CRC patients with lower MACC1 expression had a better prognosis than those with higher MACC1 expression

5 MACC1基因表达量与错配修复基因表达的相关性

应用GEPIA数据库中“Correlation Analysis”功能，分析MACC1基因表达情况与错配修复基因MSH2、MSH6、MLH1和PMS2相关性情况，发现MACC1与上述基因的表达呈现显著相关性（均P＜0.01，图5）。

图5 来自GEPIA数据库的分析显示结直肠癌中MACC1基因表达与错配修复基因（MSH2、 MSH6、MLH1、PMS2）表达具有显著相关性Fig. 5 Data from the GEPIA database showed the expression of the MACC1 gene was significantly correlated with the expression of mismatch repair genes MSH2, MSH6, MLH1, and PMS2

讨 论

MACCl基因定位于人类染色体（7p21.1），在2009年由Stein等在结肠癌患者中首先发现[3]。随后大量基因和蛋白质组学层面的研究证实MACC1在多种实体恶性肿瘤如结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌等组织中异常高表达，且与肿瘤临床分期、远处侵袭转移、患者预后等密切相关，具有作为恶性肿瘤转移和预后判断的独立指标价值，能为基因治疗提供新靶点[7,8]。MACC1在CRC中已有较多研究[9-13]，可以肯定的是，MACC1在CRC中的异常高表达在肿瘤浸润转移、预后等发挥重要作用，可以作为CRC转移、预后等的预测和标志物的作用，是CRC新的治疗靶点。本项目组前期[6,9]及本实验亦证实了MACC1在77例CRC中的表达及临床病理意义，MACC1在CRC组织中的异常高表达与淋巴结转移、神经侵犯和临床分期有关。为了进一步深入研究MACC1在CRC中的作用机制及价值，结合自身初步研究并利用数据库进行大数据挖掘，以达到有效利用已有信息资源，降低科研成本，缩短科研周期的目的。

HPA数据库提供24000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息，是一个大规模蛋白质研究项目，免费提供给公众查询。该数据库绘制人体组织和细胞中表达基因编码的蛋白位置，可提供直观可视化的结果，便于分析统计，为发现肿瘤新的生物标记物和新的治疗靶点提供有力的证据支持[14]。本研究首先通过该数据库的组织芯片免疫组织化学证实MACC1在CRC表达异常增加，这也验证了本研究免疫组织化学结果的可靠性。该数据库597例CRC患者中高表达MACC1 mRNA的256名患者生存预后差，弥补了本研究病例缺乏生存预后资料的不足。

运用GEPIA数据库分析显示MACC1 mRNA在367例的CRC样本中表达明显高于667例正常样本，不同临床分期间的MACC1表达差异具有统计学意义。生存分析显示高表达MACC1的CRC患者的总生存率和无病生存率均明显少于低表达MACC1的患者。这些结果证实MACC1在CRC中的异常高表达，对肿瘤进展、转移及预后发挥了重要促进作用。CRC的发生机制复杂，主要涉及微卫星不稳定性和染色体不稳定性[15]。其中错配修复系统的功能减弱甚至缺失会导致微卫星不稳定，目前已经证实错配修复基因家族成员MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在CRC发生演进中起重要作用[16,17]。本研究利用GEPIA 数据库的基因相关性分析，发现MACC1基因与错配修复家族中的4种重要基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达具有显著相关性，进一步证实MACC1基因在CRC发病过程中发挥重要促癌作用。

综上所述，本研究在自身免疫组织化学研究基础上，结合HPA数据库和GEPIA数据库的大数据挖掘分析结果，避免了研究样本量过小及资料不全等不足所产生的误差，准确地分析并证实了MACC1的异常表达增高在CRC的发生和进展上具有重要作用。下一步，本研究会深入研究MACC1在CRC中的作用机制，有望为临床寻找判断侵袭转移、预后的标记物乃至治疗靶点。