药用真菌韦伯灵芝菌丝培养特性的研究*

蒋 帅，毕家豪，范宇光，曾念开▲

(1海南医学院药学院，海南 海口 571199；2海南热带雨林国家公园管理局鹦哥岭分局，海南 白沙 572800)

韦伯灵芝Ganodermaweberianum(Bres.& Henn.ex Sacc.) Steyaert在分类上隶属于多孔菌目Polyporales、灵芝科Ganodermataceae[1]。该菌最早描述于萨摩亚[2]，之后在中国台湾、云南西双版纳等地有分布的报道[3-5]；2018年，作者在海南省万宁市也发现了韦伯灵芝的分布。该菌在海南民间作为“灵芝”使用，以泡酒、煮水等方式入药，认为其对身体有保健作用[6，7]。现代研究表明，韦伯灵芝栽培的子实体含有ganoweberianones A和B、ganoweberianic acids A-G、ganohainanic acid A、Ganodermanontriol及其Ganodermanontriol异构体等化合物，其中ganoweberianones A具有良好的抗疟活性[8]；同时该菌的液体发酵产物还具有抗黑色素生成的作用[9]。因此韦伯灵芝是一种极具研究价值的药用真菌。近年来由于对包括韦伯灵芝在内的灵芝属真菌的过度采挖，使其野生资源逐年减少[10]。因此加强对韦伯灵芝的研究，对该菌的可持续利用具有重要意义。为此，本研究从韦伯灵芝生长所需营养及生长的环境因素对该菌菌丝的培养特性进行研究，以期为该菌的人工驯化栽培提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

韦伯灵芝G.weberianum菌株分离自海南省万宁市兴隆镇。分离菌株的子实体保存于海南医学院真菌标本馆(FHMU)。

1.2 供试培养基

1.2.1 PDA培养基

马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(不含氯霉素)。

1.2.2 碳源实验所用基础培养基(CK1)

MgSO40.05%、KH2PO40.1%、琼脂粉2%、蛋白胨0.2%。

1.2.3 氮源实验所用的基础培养基(CK2)

MgSO40.05%、KH2PO40.1%、琼脂粉2%、葡萄糖2%。

1.3 菌种活化

将供试的韦伯灵芝菌种移至PDA培养基平板中心，控制培养条件，待菌落直径长至6～8 cm时，用无菌打孔器在离平板中心等距离处(同菌龄菌丝体)打孔，获得活化菌种块，供接种用。

1.4 接种培养与观测方法

灭过菌的培养基在超净工作台中趁热定量倒入灭过菌的9 cm培养皿中制成平板，待培养基冷却凝固后，每平板中心接入1块直径约0.5 cm的活化菌种块，每一处理4次重复；置于培养箱黑暗条件下培养；每隔2 d测量菌落半径，观察菌落的变化及其生长势。

1.5 处理方法

1.5.1 碳源对菌丝生长的影响

分别用2%葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、木糖、糊精、可溶性淀粉加入碳源基础培养基CK1中，接种韦伯灵芝菌种，于26 ℃下培养6 d。

1.5.2 氮源对菌丝生长的影响

分别用0.2%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸铵加入氮源基础培养基CK2中，接种韦伯灵芝菌种，于26 ℃下培养5 d。

1.5.3 温度对菌丝生长的影响

采用PDA培养基，分别在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃下，接种韦伯灵芝菌种，培养4 d。

1.5.4 起始pH值对菌丝生长的影响

采用PDA培养基，分别用2 mol/L氢氧化钠溶液和2 mol/L盐酸溶液调节培养基的起始pH值为 4、5、6、7、8，接种韦伯灵芝菌种，于26 ℃下培养5 d。

2 结果与分析

2.1 碳源对韦伯灵芝菌丝生长的影响

在供试的7种碳源中，韦伯灵芝菌丝接种后的第2天均能萌发，但不同碳源对菌丝生长的影响不同。从生长势来看，糊精为碳源的菌落生长最为密集，其后是可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和木糖(图1和表1)；从菌落半径来看，培养6 d的菌落半径从大到小依次为：糊精>果糖>可溶性淀粉>麦芽糖>葡萄糖>蔗糖>木糖(表1)。统计学测验结果显示，以糊精为碳源时，培养6 d的菌落半径和其他碳源进行培养所得的菌落半径相比具有显著性差异(表1)。因此，以糊精为碳源，不仅菌丝生长最为快速，而且菌丝生长浓密。所以判断韦伯灵芝的最适碳源为糊精。

a-葡萄糖；b-麦芽糖；c-果糖；d-蔗糖；e-木糖；f-糊精；g-可溶性淀粉。图1 不同碳源下培养6 d的韦伯灵芝菌落Fig.1 The colony of G.weberianum after 6 d culturewith different carbon sources

表1 不同碳源下培养6 d的韦伯灵芝菌落半径及生长势Tab.1 The colony radius s.d.，n=6) andmycelial growth of G.weberianum after 6 d culture withdifferent carbon sources

续表1

2.2 氮源对韦伯灵芝菌丝生长的影响

在供试的4种氮源中，在接种后1 d均能萌发，但各个氮源对菌丝生长的影响不同。从生长势来看，以酵母粉为氮源的菌落生长最为密集，其后依次是蛋白胨、牛肉膏和硫酸铵(图2和表2)；从菌落半径来看，培养5 d的菌落半径从大到小依次为：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>硫酸铵(表2)。统计学测验结果显示，以酵母粉为氮源时，培养5 d的菌落半径和其他氮源进行培养所得的菌落半径相比具有显著性差异(表2)。由此可以判断韦伯灵芝的最适氮源是酵母粉(表2)。

a-蛋白胨；b-酵母粉；c-硫酸铵；d-牛肉膏。图2 不同氮源下培养5 d的韦伯灵芝菌落Fig.2 The colony of G.weberianum after 5 d culture withdifferent nitrogen sources

表2 不同氮源下培养5 d的韦伯灵芝菌落半径及生长势

2.3 温度对韦伯灵芝菌丝生长的影响

在供试的6种温度下，接种后1 d菌丝都能萌发，说明韦伯灵芝在24～34 ℃都能生长，但不同温度对菌丝生长影响不同。从生长势来看，30 ℃菌丝生长最为密集，其后依次是32 ℃、28 ℃、26 ℃(图3和表3)；从菌落半径来看，培养4 d的菌落半径从大到小依次为：28 ℃>30 ℃>26 ℃>32 ℃>24 ℃>34 ℃(表3)。统计学测验结果显示，培养温度为28 ℃与32 ℃时，对培养4 d的韦伯灵芝菌落半径影响差异不显著，但二者与其他温度处理下的菌落半径有显著性差异(表3)。由此可判断韦伯灵芝的适宜生长温度为28～32 ℃。

a-24℃；b-26 ℃；c-28 ℃；d-30℃；e-32℃；f-34℃。图3 不同温度下培养4 d的韦伯灵芝菌落Fig.3 The colony of G.weberianum after 4 d culture atdifferent temperatures

表3 不同温度下培养4 d的韦伯灵芝菌落半径及生长势

2.4 起始pH值对韦伯灵芝菌丝生长的影响

在供试的5种不同起始pH值下，接种后两天所有菌丝都能萌发。从菌丝生长势来看，在起始pH6时，菌丝最为密集，其后依次是pH7、pH5、pH8、pH4(图4和表4)。从菌落半径来看，培养5 d的菌落半径从大到小依次为：pH6>pH5>pH7>pH8>pH4(表4)。统计学测验结果显示，起始pH6下的菌落半径与其他pH值下菌落半径具有显著性差异，且pH6下菌丝生长密集(图4)。由此可判断韦伯灵芝菌丝生长的最适起始pH值是6。

表4 不同起始pH值下培养5 d的韦伯灵芝菌落半径及生长势mycelial growth of G.weberianum after 5 d culture withdifferent initial pH values

a-pH=4；b-pH=5；c-pH=6；d-pH=7；e-pH=8。图4 不同起始pH值下培养5 d的韦伯灵芝菌落Fig.4 The colony of G.weberianum after 5 d culture withdifferent initial pH values

3 讨论

碳源比较实验结果表明，韦伯灵芝菌丝能广泛利用各种碳源，但最适的碳源是糊精。这与灵芝属其他种类有所不同，如有柄树舌G.gibbosum(Blume & T.Nees) Pat.的最适碳源是蔗糖[11]，赤芝G.lingzhiSheng H.Wu，Y.Cao & Y.C.Dai的最适碳源为蔗糖，树舌灵芝G.applanatum(Pers.) Pat.的最适碳源为葡萄糖，紫芝G.sinenseJ.D.Zhao，L.W.Hsu & X.Q.Zhang的最适碳源为麦芽糖[12]。氮源比较实验结果表明，韦伯灵芝菌丝能利用有机氮如蛋白胨、酵母粉和牛肉膏，同时也能利用无机氮如硫酸铵，但最适的氮源为酵母粉。灵芝属的其他种类如有柄树舌、赤芝、树舌灵芝、紫芝的最适合氮源也是酵母膏[11，12]。温度比较实验结果表明，韦伯灵芝在24～34 ℃能生长，但在28 ℃下的菌丝生长最快，说明该菌是一种高温型真菌[13]；灵芝属的其他种类如有柄树舌菌丝生长的最适温度为25 ℃[11]，树舌灵芝的适合温度为25～30 ℃，赤芝和紫芝的最适合温度均为25 ℃[12]。起始pH值比较实验结果表明，韦伯灵芝菌丝的最适起始pH值是6，其他灵芝属的种类如有柄树舌菌丝生长的最适起始pH值为5.5[11]。

在中国，赤芝、紫芝、白肉灵芝G.leucocontextumT.H.Li，W.Q.Deng，Sheng H.Wu，Dong M.Wang & H.P.Hu、松杉灵芝G.tsugaeMurrill等灵芝属真菌已经有较大规模的人工栽培[14-16]，为中国的大健康产业发挥着重要的作用。韦伯灵芝具有良好的药理活性，且是典型的热带物种，因此对其培养特性进行研究，不仅为该灵芝的人工驯化栽培、菌丝体液体发酵等提供重要的基础数据，而且为中国热带灵芝属真菌的保护提供了参考。