家蚕幼虫体腔注射脂多糖和大肠杆菌对BmRelA基因表达的影响

司徒金容 何艳影 李佳璇 刘吉升(广州大学生命科学学院，广东广州 510006)

昆虫没有获得性免疫系统(acquired immune system)，只有先天免疫系统(innate immune system)。昆虫通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)来识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，继而引发下游的细胞免疫和体液免疫[1]，对抵抗外源病原体和维护内环境的稳定起着重要的作用[2]。昆虫的先天免疫有Toll、IMD(immune deficiency,免疫缺陷)和JAK/STAT(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,Janus激酶/信号转换器和转录激活因子)等3条信号通路，通过信号转导及免疫途径调控免疫相关基因的表达，诱导抗菌肽和其他效应分子的产生[3]。Toll信号转导途径对抵抗病原微生物的先天性免疫应答起着至关重要的作用[4]，其中Rel是Toll通路中的关键因子[5]，参与抗菌肽激活的调节[6]，在发育、炎症、凋亡、细胞增殖和分化等许多生理过程中都起着重要的调控作用[7]。

Rel蛋白在Toll通路上的研究，目前以黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)最为深入。在黑腹果蝇中，Toll样受体是细胞上的跨膜受体蛋白，发生微生物感染时，Toll蛋白借助它的TIR(toll/interleukin-1 receptor)结构域与胞浆内的MyD88(myeloid differentiation factor 88，髓样分化因子88)和Tube蛋白相互作用。MyD88、Tube和Pelle基于Toll蛋白传来的信号在胞浆内形成复合体，缺失这些蛋白而无法形成复合体的果蝇不能抵御微生物感染。信号从该复合体传给可诱导的Rel/NF-κB家族顺式激活子。Rel/NF-κB是昆虫和哺乳动物先天性免疫系统中共有的转录因子，与防御入侵微生物的结构性和功能性相关[8]。该因子在胞浆中与Rel蛋白的抑制子Cactus形成复合体，促使蛋白激酶磷酸化Rel蛋白，磷酸化的Rel蛋白被转运到细胞核调节靶基因表达[9]。Rel/NF-κB信号通路在昆虫体液免疫中发挥重要作用，通过活化Rel蛋白进入细胞核中与κB因子结合，从而调节靶标基因的表达[10]。

家蚕(Bombyxmori)是继黑腹果蝇、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)后第3个完成全基因组测序的模式昆虫，也是第1个完成测序的鳞翅目昆虫，经全基因组筛查获得免疫相关基因203个[11]。在家蚕中，编码Rel蛋白的cDNA有BmRelA和BmRelB，它们除5′区域外均显示相同的核苷酸序列，这2个Rel蛋白都参与了抗菌肽基因的激活，BmRelB强烈激活Attacin和Lebocin3基因，BmRelA强烈激活Lebocin4基因，而Attacin和Lebocin3基因非常弱，Rel蛋白的微小结构变化可引起抗菌肽基因的显著差异激活，这提示Rel因子对昆虫抗菌肽基因表达的新型调节机制[6]。

在我们前期试验中发现，用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和大肠杆菌(Escherichiacoli)给家蚕5龄幼虫添食可以诱导MyD88基因在家蚕幼虫的免疫反应，且不同组织会出现不同程度的免疫反应[12]。本研究采用体腔注射处理家蚕5龄幼虫，利用PCR和凝胶电泳技术进一步探究BmRelA基因对脂多糖和大肠杆菌的应答情况，以期揭示BmRelA基因对外源病原体的免疫反应，为深入研究家蚕Toll信号通路的分子机理奠定基础，并为家蚕抗病能力及家蚕抗菌物质的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫 本试验所用家蚕品系为“大造”(P50)，由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所惠赠。孵化后的幼虫在温度(25±1)℃，相对湿度60%～70%，每日上午7：00起连续12 h光照(L)之后再连续12 h黑暗(D)(L∶D=12∶12，即L为7：00AM—7：00PM，D为7：00PM—7：00AM)的条件下，以新鲜桑叶饲养。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq、DL2000 DNA Marker等试剂，均为宝日医生物技术(北京)有限公司(大连TaKaRa公司)产品；Lipopolysaccharides fromEscherichiacoliO111：B4，为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品；琼脂糖M，为BBI公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 T100 Thermal Cyclers PCR仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统，均为Bio-Rad公司产品；CentrisartA-14C离心机、BSA224S电子天平，均为Sartorius公司产品；NanoDrop 2000超微量分光光度计、-80 ℃超低温冰箱，均为Thermo Fisher公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 家蚕幼虫注射处理试验及解剖取样 随机选取36条5龄第1天家蚕幼虫，以体腔注射10 μL脂多糖溶液(0.25 μg/μL)或经灭活处理的大肠杆菌液稀释液(2.5×104cells/μL)为试验组，以体腔注射10 μL无菌水为对照组，共3种处理，每种处理12头。

在注射前0 h、注射后3 h、6 h和24 h进行平行取样，每种处理每个时间点取3头家蚕，每头家蚕解剖后分别取中肠、表皮和脂肪体3种组织。所有样品迅速置于无RNA酶的离心管中，存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 总RNA的提取和cDNA的合成 使用 RNAiso Plus试剂盒，按其说明书的操作提取以上组织的总RNA，并用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA的质量和浓度，置于-80 ℃冰箱保存。

参照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用说明书操作，采用10 μL反应体系进行反转录，反应条件为25 ℃、10 min，42 ℃、60 min，4 ℃保存。扩增产物置于-20 ℃冰箱保存，以此为模版进行PCR反应。

1.2.3 目的基因的PCR扩增 引物均使用Primer Premier 6.0软件进行设计(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。检测基因为BmRelA基因(GenBank登录号：NM_001043431)，内参基因为家蚕BmActinA3看家基因(GenBank登录号：NM_001126254)。使用Taq试剂盒和10 μL反应体系，进行PCR扩增。BmRelA扩增条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35次循环后，72 ℃延伸10 min。BmActinA3扩增条件与BmRelA稍有不同，BmActin退火温度为53 ℃，循环数为28次。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件采用100 V、14 min。溴化乙锭染色后，利用紫外凝胶成像仪观察电泳条带。

表1 BmRelA基因和BmActinA3基因的引物序列

1.3 数据处理

利用Quality One图像分析软件对凝胶条带进行定量分析。参照软件说明，通过校正原凝胶电泳图的亮度和对比度，统一背景色调；调整目标条带宽度并重新编号计算；框选目的条带后平衡条带峰值；分析量化条带亮度后导出数据。对脂多糖、大肠杆菌处理的试验组和无菌水处理的对照组进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并进行Turkey法多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对中肠组织中BmRelA基因表达的影响

琼脂糖凝胶电泳显示，注射处理后24 h内BmRelA基因和BmActinA3基因在家蚕5龄幼虫中肠组织中均有表达。经无菌水注射处理，中肠组织中BmActinA3基因在4个时间点的条带亮度相近，BmRelA基因在3 h和6 h条带亮度与0 h相近，在24 h条带亮度减弱(图1-A)；经脂多糖注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h条带亮度增强，在24 h时的条带最亮(图1-B)；经大肠杆菌注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h 和6 h条带亮度与0 h相近，在24 h条带亮度增强(图1-C)。通过Quality One软件进一步验证发现，经无菌水注射处理，中肠组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h和6 h相比0 h无显著差异，在24 h 有所下调；经脂多糖注射处理，中肠组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h、6 h和24 h显著上调；经大肠杆菌注射处理，中肠组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h和6 h 相比0 h无显著差异，在24 h显著上调(图2)。根据凝胶电泳的条带亮度并结合Quality One软件表达量的分析，在中肠组织中，脂多糖和大肠杆菌的注射处理均会诱导BmRelA基因上调表达，在测定的时间范围内以24 h时的诱导效果最好；其中，脂多糖注射处理诱导的效果更好。

图1 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水(A)、脂多糖(B)和大肠杆菌(C)后中肠组织中BmRelA基因的凝胶电泳图

图中数据为同一次试验的3个重复的平均值±标准差；柱上不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。图4和图6相同。图2 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水、脂多糖和大肠杆菌后不同时间中肠组织中BmRelA基因的相对表达量

2.2 不同处理对表皮组织中BmRelA基因表达的影响

琼脂糖凝胶电泳显示，注射处理后24 h内BmRelA基因和BmActinA3基因在家蚕5龄幼虫表皮组织中均有表达。经无菌水注射处理，表皮组织中BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h条带亮度减弱(图3-A)；经脂多糖注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在6 h和24 h条带亮度与0 h相近，在3 h条带亮度减弱(图3-B)；经大肠杆菌注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h条带亮度略微增强，在6 h和24 h条带亮度明显增强(图3-C)。通过Quality One软件进一步验证发现，经无菌水注射处理，表皮组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h、6 h和24 h有所下调；经脂多糖注射处理，表皮组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h有所下调，在6 h、24 h相比0 h无显著差异；经大肠杆菌注射处理，表皮组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h、6 h和24 h显著上调(图4)。根据凝胶电泳的条带亮度并结合Quality One软件表达量的分析，在表皮组织中，大肠杆菌注射处理诱导BmRelA基因上调表达的效果比脂多糖注射处理诱导的效果更好。

图3 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水(A)、脂多糖(B)和大肠杆菌(C)后表皮组织中BmRelA基因的凝胶电泳图

图4 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水、脂多糖和大肠杆菌后不同时间表皮组织中BmRelA基因的相对表达量

2.3 不同处理对脂肪体组织中BmRelA基因表达的影响

琼脂糖凝胶电泳显示，注射处理后一定时间内BmRelA基因和BmActinA3基因在家蚕5龄幼虫脂肪体组织中均有表达。经无菌水注射处理，脂肪体组织中BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在4个时间点条带亮度相近(图5-A)；经脂多糖注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h条带亮度增强(图5-B)；经大肠杆菌注射处理，BmActinA3基因在4个时间点条带亮度相近，BmRelA基因在3 h条带亮度增强，在6 h和24 h条带亮度略微减弱(图5-C)。通过Quality One软件进一步验证，经无菌水注射处理，脂肪体组织中BmRelA基因的相对表达量在4个时间点无显著差异；经脂多糖注射处理，脂肪体组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h、6 h和24 h显著上调；经大肠杆菌注射处理，脂肪体组织中BmRelA基因的相对表达量在3 h显著上调，在6 h和24 h有所下调(图6)。根据凝胶电泳的条带亮度并结合Quality One软件表达量的分析，在脂肪体组织中，脂多糖和大肠杆菌的注射处理均能诱导BmRelA基因上调表达；其中，脂多糖的注射处理诱导BmRelA基因上调表达的效果更好。

图5 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水(A)、脂多糖(B)和大肠杆菌(C)后脂肪体组织中BmRelA基因的凝胶电泳图

图6 家蚕5龄幼虫体腔注射无菌水、脂多糖和大肠杆菌后不同时间脂肪体组织中BmRelA基因的相对表达量

3 小结与讨论

据统计，每年因蚕病造成蚕茧经济损失达20%左右[13]。因此，开展家蚕天然免疫系统的研究，有助于对家蚕免疫基因的了解，以提升其抵御外源病原体的能力。家蚕既是支撑蚕丝产业的生物基础，又是鳞翅目昆虫研究的典型模式种类，通过对家蚕免疫相关基因的研究，可为其他生物的相关疾病研究提供一定的比较和参考。

本试验对家蚕5龄幼虫进行脂多糖注射处理，结果显示，脂多糖注射处理后，引起中肠和脂肪体组织中BmRelA基因上调表达。脂多糖是大多数革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，能诱发宿主细胞固有免疫反应，其结构组成与细菌致病能力息息相关[14]。大肠杆菌注射处理试验显示，在3个组织中BmRelA基因都出现了上调表达。

通过比较脂多糖和大肠杆菌诱导BmRelA基因的表达水平，可以推断，脂多糖和大肠杆菌均能够诱导BmRelA基因的上调表达。在表皮组织中，大肠杆菌诱导BmRelA基因上调表达的诱导效果更好；在中肠和脂肪体组织中，脂多糖的诱导效果更好。推测可能是由于脂多糖仅是细菌细胞壁的成分之一[15]，大肠杆菌细胞壁中脂多糖含量较低，不如脂多糖注射处理试验组的脂多糖溶液含量高，故注射脂多糖诱导家蚕幼虫BmRelA基因的上调表达更显著。

家蚕模式识别受体的发现是家蚕先天免疫研究的开始，昆虫的某些特定器官也有特定的免疫作用。中肠是昆虫免疫重要的物理屏障和肠道的重要免疫中心[16-17]；表皮是微生物的主要防御系统，其腺体可以分泌防御性物质，以驱除捕食者和寄生者[18]；脂肪体作为重要的免疫反应器官，分泌合成了多种与分子免疫相关的蛋白，如抗菌肽Cecropins、Defensins等[19]。脂多糖注射处理后3 h、6 h和24 h，均诱导BmRelA基因在中肠和脂肪体组织中上调表达，说明BmRelA可能在其中参与免疫调节反应。大肠杆菌注射处理后3 h，脂肪体组织中BmRelA基因上调表达，直至大肠杆菌注射处理后24 h，中肠组织中BmRelA基因才上调表达，由大肠杆菌诱导BmRelA基因上调表达出现的时间推测，外源病原体引起家蚕体液免疫调节的顺序如下：首先，在脂肪体组织中引起体液免疫，紧接着在中肠组织中引发，家蚕肠道在细菌感染后期产生的抗菌肽扮演着清除肠道内细菌的角色[15]，免疫调节的作用较强。梁九波[20]的微生物诱导实验表明，家蚕表皮蛋白BmCPT1经微生物诱导后仅能在家蚕血浆中被检测到，而一些免疫相关蛋白也与此相类似。由此推测，家蚕表皮能够传递外界不良的刺激，而引起下游的免疫联级反应，在其他组织引起相关免疫基因的上调表达。

脂多糖为哺乳动物TLR4 (toll-like receptor 4)的主要配体，TLR4通过识别并结合相应配体，启动激活信号转导途径，通过刺激TIR超家族成员激活转录因子NF-κB[21-22]，释放NF-κB中常见的p60/p50和p50/c-Rel二聚体或p52/RelB迅速转移至细胞核，调控各种κB依赖基因的表达[23]。昆虫的Toll9受体和哺乳动物TLR4进化关系较为接近，由此推测在家蚕Toll通路中有与哺乳动物TLR4相似的脂多糖诱导信号转导途径。

综上所述，BmRelA基因在家蚕幼虫的中肠、表皮和脂肪体组织中被外源病原菌在不同程度诱导上调表达，推测BmRelA基因参与了对这些外源病原菌的免疫应答。后期还需要进行家蚕幼虫喂食脂多糖的试验，对比喂食试验有助于研究家蚕从口中摄入细菌和从体表注射细菌后BmRelA基因表达的区别，进一步了解和完善家蚕Toll信号通路的免疫机制。