蓝光碳量子点作为荧光探针检测4-硝基苯酚和2-硝基苯酚

邹 宇，唐明宇，曲姚姚，张 芳，柴 芳*

(1． 哈尔滨师范大学化学化工学院 光化学生材料与储能材料黑龙江省重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150025；2. 北部湾海洋新材料研究院，广西 北海 536015)

1 引 言

作为新型的零维碳纳米材料，碳点以其优异的荧光性质、物理化学稳定性、生物相容性、低毒性和可以批量生产等特点，在催化剂[1]、发光二极管(LED)[2]、荧光传感器[3]、生物显像剂和纳米药物等领域[4]具有潜在的应用价值[5]而引起了研究者的广泛关注[6]。其中，荧光分析探针是重要的研究方向之一。

硝基芳化合物如对硝基苯酚和邻硝基苯酚具有毒性，常用作合成染料、皮革加工、药物生产、加工指示剂等生产过程中的中间体。硝基苯酚化合物在生产生活中可能进入河流中甚至渗入土壤和地下水中，还可以通过呼吸、接触等方式进入人体刺激眼睛、呼吸、消化和代谢系统。由于其在水体中良好的溶解性和稳定性，可长期存在于废水中，对环境造成严重危害，直接影响到生态环境和人类健康[7]。目前，在现有的标准分析方法中，如荧光法[6]、分光光度法[8]、气相色谱法[9-10]，利用碳点作为荧光探针对爆炸物检测已有一些报道。如Yuan等制备了氮掺杂的蓝光碳点用于检测对硝基苯酚[8]，Ahmed等报道了蓝光碳点作为荧光探针检测地表水中的对硝基苯酚[9]。Dang等利用均苯四甲酸合成出高亮荧光氮掺杂碳点用于测定对硝基苯酚[10]，Yang等将葡萄糖胺制成氮掺杂碳点可高灵敏检测对硝基苯酚，并基于“on-off”机制检测Cr(VI)和抗坏血酸[11]。

本文利用简单一锅法合成了蓝色荧光碳点(MSA-CDs)，通过TEM、XPS、FT-IR、UV-Vis和荧光光谱对制备的MSA-CDs进行了表征和分析。研究了MSA-CDs的激发、发射性质，以及MSA-CDs在不同pH、离子强度和储存时间条件下的稳定性。为考察真实环境对探针的影响，探究了MSA-CDs在实际水样中对2-NP和4-NP的检测情况，并进一步分析了其对MSA-CDs荧光的猝灭机理。

2 实 验

2.1 试剂和表征

巯基丁二酸(Mercaptosuccinic acid，98%)、甲酰胺(Formamide，98%)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP，98%)及乙醇(AR)购于阿拉丁试剂公司；邻硝基苯酚(2-NP，98%)、间硝基苯酚(3-NP，98%)、对硝基苯酚(4-NP，98%) 购于国药试剂公司；硝基苯(NB，98%)和甲苯(Toluene，98%) 购于北京化学试剂公司。

表征所用的透射电镜(TEM)型号是FEI Tecnai G2 F20 TEM，紫外-可见光谱通过日本岛津UV-2550紫外-可见分光光度计测得，荧光光谱由美国PerkinElmer LS-55荧光光谱仪测试，红外光谱采用日本JASCOFT/IR-420红外光谱仪测试。 通过AXIS Ultra DLD光谱仪测试了碳点的XPS。

2.2 荧光巯基丁二酸碳量子点制备

将0.21 g 巯基丁二酸和12.5 mL 甲酰胺搅拌充分混合，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，在160 ℃烘箱加热1 h。待产物冷却至室温后，将得到的深棕色溶液透析(3 500 u)，纯化后的溶液即为MSA-CDs。然后取出溶液密封存放在4 ℃冰箱中待用。为探究最佳的合成条件，在制备过程中将不同反应温度(120～200 ℃)、反应时间(0.5～2 h)及两种反应物质量比(巯基丁二酸质量0.10，0.21，0.42 g，甲酰胺的用量不变)的情况分别进行了考察。

2.3 碳点对硝基芳香化合物的选择性

2.4 邻硝基苯酚和对硝基苯酚的灵敏度

为考察MSA-CDs对2-NP的灵敏度，向200 μL MSA-CDs溶液中分别加入等体积的不同浓度的2-NP溶液(10-9～10-3mol/L)，反应20 min后测试并比较样品的荧光光谱。探针对4-NP的检测灵敏度的研究过程与2-NP相同。

2.5 实际水样中的检测

为了验证MSA-CDs探针在真实环境中的检测性能，在实际水体中对2-NP和4-NP进行了检测。收集了查干湖水样，并用孔径为0.22 μm的滤膜对收集的水样进行过滤处理。然后采用标准加入法将2-NP和4-NP(浓度分别为0.2，0.5,1.0 μmol/L)加入到湖水样品中，最后对回收率数据进行了测试、计算和比较。

3 结果与讨论

3.1 MSA-CDs组成和结构

图1是MSA-CDs的合成和检测过程示意图。由于巯基丁二酸分子中有—COOH和—SH基团，甲酰胺具有—NH2基团，作为碳源，巯基丁二酸和甲酰胺合成碳点过程中，引入了S和N掺杂元素，这对于提高碳点的荧光量子产率十分有利。反应得到的MSA-CDs在紫外灯照射下发出明亮的蓝色荧光(λ=365 nm)。由于合成的MSA-CDs表面富含氨基，与2-NP和4-NP作用产生荧光猝灭现象，因此MSA-CDs可以作为一种潜在的荧光检测探针识别这两种化合物。

图1 MSA-CDs合成及作为荧光传感器用于检测2-NP和4-NP示意图

首先讨论合成MSA-CDs的反应条件，分别对反应时间、温度及反应物配比对MSA-CDs的荧光性质的影响进行了研究。图2(a)为在不同反应时间(0.5，1，1.5，2 h)所制备的MSA-CDs的荧光光谱。通过图中的曲线观察到在437 nm处的发射峰为碳点的荧光发射峰，反应时间为1 h 的条件下MSA-CDs的荧光强度最高，因此最佳反应时间为1 h。合成实验进一步优化了反应温度，如图2(b)所示，反应温度分别为120，140，160，180，200 ℃，在160 ℃条件下，荧光强度最高，因此探究出反应的最佳温度为160 ℃。图2(c)为探究反应物不同比例的荧光光谱。反应中甲酰胺均为12.5 mL，加入巯基丁二酸的质量分别为0.10,0.21,0.42 g，实验结果表明加入0.21 g的巯基丁二酸时，荧光强度最高，因此，最佳条件为0.21 g巯基丁二酸与12.5 mL甲酰胺反应。插图分别为日光灯和紫外灯下不同反应条件下的样品图片，与荧光光谱反应的结果一致。综上所述，合成MSA-CDs的最佳反应条件是将0.21 g巯基丁二酸和12.5 mL甲酰胺在高压反应釜中反应，反应时长为1 h，反应温度为160 ℃。后面检测实验中所用的MSA-CDs均为在该条件下合成。

图2 (a)不同反应时间制备的MSA-CDs的荧光光谱；(b)不同反应温度合成的MSA-CDs的荧光光谱；(c)不同质量反应物合成的MSA-CDs的荧光光谱(插图分别为相应的样品在自然光和紫外灯下的照片)。

TEM用来揭示碳点的尺寸和形貌，从图3(a)中可以观察到MSA-CDs呈现大小均匀的准球形颗粒，具有良好的分散性。通过对100个单独的MSA-CDs粒子粒径测量并进行高斯拟合后，得出一个较宽的粒径分布，碳点的平均粒径为(3.03±0.028) nm(图3(b))。由图3(a)中插图HRTEM图像计算得到MSA-CDs的晶格间距为0.21 nm，可归属为石墨(100)晶面[12]。

图3 (a)MSA-CDs的TEM图像，插图是单个MSA-CDs的HRTEM；(b)MSA-CDs的粒径分布。

图4 MSA-CDs的XPS全谱(a)、C 1s谱(b)、O 1s谱(c)、N 1s谱(d)、S 2p谱(e)、红外光谱(f)。

3.2 MSA-CDs 的光学性质

各市发改委主任及工作助手，省发改委机关副处级以上干部，省能源局、省粮食和物资储备局、省工程咨询院、省宏观经济研究院、山东发展投资控股集团有限公司班子成员，委机关服务中心、委信息中心、齐鲁周刊社主要负责同志参加会议。

图5 (a)MSA-CDs的紫外-可见吸收光谱、荧光激发和发射光谱；(b)在不同激发条件下(300～400 nm)的荧光光谱；(c)1931 CIE色度坐标，插图：自然光下和紫外灯下的照片。

为考察MSA-CDs的稳定性，分别研究了pH、离子强度和储存时间对其荧光强度的影响。首先探究了pH值对碳点荧光强度的影响(图6(a))。当pH值在1～11范围时，MSA-CDs的荧光强度几乎不变；当pH值在12～14之间时，荧光强度出现剧烈下降，这是由于MSA-CDs表面的—COOH发生离子化作用使荧光强度降低[25]。接着探究储存时间的影响，每间隔2 h测试一次MSA-CDs的荧光光谱，发现12 h内MSA-CDs荧光强度趋于稳定(如图6(b)所示)。我们还讨论了离子强度对碳点荧光的影响，通过模拟加入不同浓度的NaCl溶液来测试混合后MSA-CDs的荧光强度变化。如图6(c)所示，发现即使在1 mol/L的高浓度NaCl溶液的条件下，MSA-CDs的荧光强度也没有发生明显的变化，证明碳点的荧光不受高离子强度影响。以上实验结果说明探针对复杂测试环境具有一定的容忍性，良好的稳定性为MSA-CDs应用于实际水样中奠定了基础。

图6 MSA-CDs的荧光强度比率I/I0(I和I0分别代表样品和空白的荧光强度)在pH=1～14(a)、储存不同时间(b)和不同浓度的NaCl(c)条件下的变化曲线。

3.3 MSA-CDs对硝基芳香化合物的选择性

将MSA-CDs作为探针检测硝基芳香化合物，首先考察了选择性。图7(a)为MSA-CDs与不同种类的硝基类化合物混合后测试的荧光光谱，可以看到混合2-NP和4-NP的样品在437 nm处荧光强度明显下降。其他样品的荧光发射强度几乎保持不变。这意味着MSA-CDs的荧光发射易受2-NP和4-NP的影响。从样品在紫外灯下的图像中可以观察到(图7(b))，在紫外灯照射下，加入2-NP和4-NP后MSA-CDs的荧光强度降低，而MSA-CDs的荧光强度在加入其他硝基类化合物后没有发生明显变化。从图7(c)样品的荧光强度(I)和空白样品的荧光强度(I0)比值的柱形图中可以看出，2-NP和4-NP与其他样品呈现明显对比，证明MSA-CDs对2-NP和4-NP

图7 (a)MSA-CDs与不同种类的硝基类化合物混合后的荧光光谱；(b)相应的紫外灯下的图像；(c)各样品荧光强度比(I/I0)。

有一定选择性，但MSA-CDs无法区分这两种化合物，这是该探针的缺陷。

由于硝基芳香化合物共存的情况较多，实际水体环境中可能存在各种不可避免的干扰，如金属离子，因此，考察了在其他硝基芳香化合物及金属离子共存条件下，MSA-CDs对2-NP和4-NP的检测情况。在2-NP或4-NP存在的条件下，所有干扰硝基类化合物和分析物用量比为1∶1(v∶v)。样品与空白强度之比(I/I0)(如图8，9)显示，在其他硝基类化合物及金属离子与2-NP或4-NP共存情况下，2-NP和4-NP仍能将MSA-CDs的荧光猝灭，表明其他硝基芳香化合物对MSA-CDs检测2-NP和4-NP无明显干扰。

图8 MSA-CDs及与各种硝基芳香化合物(10-3 mol/L)混合后的荧光强度比(I/I0)

图9 MSA-CDs及与各种金属离子(200 μmol/L)混合后的荧光强度比(I/I0)

3.4 MSA-CDs对2-NP和4-NP灵敏度的检测

在相同的检测条件下，探究了MSA-CDs对2-NP和4-NP的检测灵敏度。图10为探针与不同浓度2-NP和4-NP的荧光光谱，及根据荧光强度与浓度变化的线性关系，依据这些数据对2-NP和4-NP的灵敏度进行计算。如图10(a)所示，随着加入2-NP的浓度(10-9～10-3mol/L)逐渐升高，观察到探针位于437 nm处的荧光强度逐渐降低，从图10(a)的插图中可以观察到探针荧光强度随2-NP的浓度升高而逐渐猝灭的现象。在2-NP浓度检测范围0.01～1 mol/L之间，MSA-CDs与2-NP的浓度存在良好的线性关系(图10(b))，得到的线性方程可以表示为y=-0.575x+0.853(R2=0.99)，通过检测限的计算公式3δ/k得出检测限为24.0 nmol/L。同样，图10(c)中随着4-NP的浓度增加样品的荧光强度逐渐减弱。在紫外灯(λ=365 nm)照射下,观察到对应的样品的蓝色荧光逐渐变暗，这与荧光发射光谱变化相一致。

图10 (a)不同浓度2-NP与MSA-CDs的荧光光谱(插图为样品在紫外灯下的图片)；(b)MSA-CDs的荧光强度与2-NP浓度的线性关系(0.01～1 mol/L)；(c)不同浓度4-NP与MSA-CDs的荧光光谱(插图为样品在紫外灯下的图片)；(d)MSA-CDs的荧光强度与4-NP浓度的线性关系(0.01～1 mol/L)。

在图10(d)中表现出良好的线性相关性。在检测0.01～1 mol/L范围内相关线性方程为y=-0.759x+0.763(R2=0.98)，计算出检测限为18.3 nmol/L。

为考察MSA-CDs在真实环境中的检测行为，以查干湖水为实际水样，进行了模拟环境检测应用。首先用探针对湖水样品进行了检测，结果表明，湖水中两种化合物的含量低于探针的检测限，因此进行了添加模拟检测研究。从表1可知，加入10-4，5×10-5，10-5mol/L的2-NP后，样品回收率在98%～101%之间，相对标准偏差(RSD)为1.8%～2.6%。MSA-CDs对4-NP的回收率在98%～99%之间，相对标准偏差(RSD)值为1.6%～2.4%。根据MSA-CDs在实际水样中的检测性能，表明该检测体系在实际水样中对2-NP和4-NP的检测具有一定的环境容忍性。

表1 环境水样中的检测结果

3.5 碳点的响应机理

为进一步探究荧光猝灭原理，分别测试了MSA-CDs及与2-NP和4-NP混合之后的荧光寿命(图11)。加入2-NP后MSA-CDs的荧光寿命为6.20 ns，混合4-NP后的荧光寿命为6.22 ns。与本实验制备的MSA-CDs荧光寿命9.45 ns对比可知，混合2-NP和4-NP后的MSA-CDs的荧光寿命明显缩短。经Stern-Volmer方程(F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q])分别计算出Kq=9.8×109(2-NP)和Kq=1.03×1010(4-NP)。由于动态猝灭的Kq通常小于2.0×1010L·mo1-1·s-1，因此，加入2-NP和4-NP后MSA-CDs发生的荧光强度降低属于动态猝灭效应[25]。通过图11(c)可以看到MSA-CDs的紫外-可见吸收光谱与激发光谱发生有效重叠且伴随荧光寿命降低，推断检测过程中发生了荧光能量共振转移(FRET)导致碳点的荧光发生猝灭[26]。

图11 MSA-CDs及其分别与2-NP(a)和4-NP(b)混合后的荧光衰减曲线；(c)MSA-CDs的荧光光谱(Ex:激发光谱，Em: 发射光谱)及2-NP和4-NP的吸收光谱。

4 结 论

我们制备了具有蓝色荧光发射的碳点MSA-CDs，荧光寿命为9.65 ns，量子产率为32%。作为荧光探针，MSA-CDs可定量检测2-NP和4-NP，最低检测限分别为24.0 nmol/L和18.3 nmol/L。通过分析发现MSA-CDs的响应机理是由于两种化合物通过分子间作用力和荧光团的荧光能量共振转移引起的，且通过比较荧光寿命判断荧光猝灭类型属于动态猝灭。在实际水样的检测中，对2-NP和4-NP具有较好的回收率，表明MSA-CDs纳米探针在环境监测中具有潜在的应用价值。

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