miR-155诱导FSTL1基因对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和免疫逃避的作用

左文娜，朱 虹，金爱燕

(河北省沧州市中心医院 耳鼻喉科，河北 沧州 061001)

鼻咽癌是发生于鼻咽黏膜上的恶性肿瘤，是我国高发的恶性肿瘤之一，发病年龄大多数集中在中年人[1]。主要病因与遗传因素、病毒感染、环境因素、种族的易感性和免疫因素相关[2]。该病地域性分布特点明显，集中发生在我国的南方地区广东和广西两个省，常见的临床症状有听力降低、鼻塞、头痛和颈部淋巴结肿大等[3]。鼻咽癌的恶性程度较高，主要采用放射治疗、手术治疗、化疗治疗、免疫治疗和中药治疗为主要手段[4]。虽然在治疗方面上有了很大的改进，但是鼻咽癌复发率和转移率仍然比较高，因此探寻新的分子标志，提高鼻咽癌的早期诊断、指导鼻咽癌的治疗以及改善鼻咽癌的治疗效果具有非常重要的作用。miRNAs是一类高度保守的非编码基因家族，在人类的多种疾病中表达升高或降低，参与了疾病的发生和发展，尤其是在肿瘤中发挥的作用越来越受到关注[5]。miR-155位于人类21号染色体上，相关研究表明，miR-155乳腺癌、肺癌、甲状腺癌等常见的癌症中表达上调，也在免疫反应和炎症反应中发挥着重要作用[6]。卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)属于分泌性细胞外糖蛋白，在细胞分化和组织损伤中起着重要作用[7]。miR-155和FSTL1基因在鼻咽癌中都出现过相关报道，但miR-155诱导FSTL1基因对鼻咽癌细胞的相关作用机制尚不清楚，因此本研究探讨miR-155诱导FSTL1基因对鼻咽癌细胞的增殖、凋亡和免疫逃避的作用，以其为鼻咽癌的治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常鼻咽上皮细胞NP69、鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z购自于中国上海市的吉凯基因化学公司；miR-155 minics、miR-155 inhibitor上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自合肥Biosharp生物公司； FSTL1、C-caspase3、Bax、 Bcl-2一抗购自于美国Gibco公司；DAB显色试剂盒购自于南京诺唯赞生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Thereto公司；Annexin V-FITC/PI双染料购自于上海七海复泰生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和转染 将人正常鼻咽上皮细胞NP69放在12%的胎牛血清RPMI-1640的培养基中培养，鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z细胞放在10%的胎牛血清RPMI-1640的培养基中培养，并加入1%的青霉素和链霉素，放于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，24h更换1次细胞培养液。进行细胞传代处理，吸出原培养基，PBS充分淋洗，0.25%胰酶消化，观察细胞形态变化，待细胞变圆轻拍掉壁时，终止消化，取对数生长期的CNE2Z细胞进行实验。转染时共计分3组，分为miR-155 minics组、miR-155 inhibitor组和NC组，将 1瓶25cm2鼻咽上皮细胞CNE2Z平均分入6孔板中，通过Lipofectamine3000转染miR-155 minics、miR-155 inhibitor和NC，按照说明书的要求进行实验。

1.3 qRT-PCR检测miR-155和FSTL1的表达 取对数生长期的鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z细胞放入Trizol细胞裂解液，提取RNA,采用Biodrop uLITE分光光度计进行RNA浓度的测定，按照RNA浓度计算1 μg RNA所需的体积，进行逆转录，使用荧光定量PCR检测试剂盒，反应体系：miR-155 mRNA上游5'-ACATTGATTATACGTGCTCGG-3'，下游5'-GCTCGGCCGAAGTTTAG-3'；FSTL1 mRNA上游5'-GTTGCGTTATCTACG-3'，下游5'-TGTTGCGTAATCTACGAT-3'；U6作为内参，引物序列为上游5'-AGTTGCGAATCTACCTACA-3'，下游5'-GATTGCGTCTACCAGTG-3',反应条件为93 ℃，6 min、92 ℃退火30 s、62 ℃延伸20 s，45个循环，用相对定量2-ΔΔCT计算各组鼻咽癌上皮细胞系中miR-155和FSTL1 mRNA水平。

1.4 CCK-8检测细胞增殖 使用CCK-8试剂盒检测鼻咽癌上皮细胞CNE2Z的增殖情况，CNE2Z细胞以1×103个/孔接种在96孔板中，转染miR-155 minics、miR-155 inhibitor和NC，分别在24、48、72、96 h将CCK-8溶液添加到每个孔中，37 ℃下孵育1 h，记录450 nm的吸光度(OD)。

1.5 流式细胞术实验检测细胞凋亡 常规消化，收集完整细胞，调整细胞的密度为1.5×105个/mL，加入到6孔板中，12 h后加入转染试剂，进行离心处理，3 000 r/min，离心10 min，离心半径为9 cm，离心后，弃去上清，重悬细胞，加入荧光染料Annexin V-FITC/PI双染色染料，上流式细胞仪的检测，FlowJo软件分析荧光值。

1.6 Western blot检测 鼻咽癌上皮细胞CNE2Z预冷，PBS冲洗3次，加入300 μL RIPA细胞裂解液进行裂解，置于1.5mL离心管内，进行离心处理，参照BCA蛋白浓度测试试剂盒测蛋白浓度，采用酶标仪确定蛋白质样本的浓度，SDS-PAGE胶电泳，转膜，取出PVDF膜，TBST洗涤，添加一抗FSTL1(稀释比例1∶500)、C-caspase3(稀释比例1∶500)、Bax(稀释比例1∶500)、Bcl-2(稀释比例1∶500)蛋白，GAPDH(稀释比例1∶1 000)为内参，孵育一抗过后12h，取出PVDF膜，孵育二抗(1∶1 000)。构建pcDNA3.1-FSTL1表达载体和pcDNA3.1空载质粒转染到鼻咽癌上皮细胞CNE2Z转染中，分别为FSTL1组和对照组，按照上述方式检测ITCH(稀释比例1∶500)和MAVS蛋白(稀释比例1∶500)，上机检测，覆盖新鲜ECL工作液，凝胶成像系统进行发光显影。

1.7 酶联免疫吸附试验 使用IFNγ ELISA试剂盒检测IFNγ水平，按照制造商的使用说明进行操作。

2 结果

2.1 miR-155和FSTL1在鼻咽上皮细胞和鼻咽癌上皮细胞中的表达 人正常鼻咽上皮细胞NP69、鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中miR-155 mRNA的相对表达量分别为1.01±0.03、3.42±0.33、3.37±0.34、3.19±0.24、2.78±0.19和2.34±0.21，与人正常鼻咽上皮细胞NP69相比，鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中miR-155 mRNA表达量明显升高(P均<0.05)；人正常鼻咽上皮细胞NP69、鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中FSTL1 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.01、0.17±0.02、0.26±0.04、0.28±0.05、0.32±0.07和0.39±0.06，与人正常鼻咽上皮细胞NP69相比，鼻咽癌上皮细胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中FSTL1 mRNA表达量显著降低(P均<0.05)，CNE2Z中FSTL1 mRNA表达量最高，所以选择鼻咽癌上皮细胞CNE2Z进行后续的实验。

2.2 miR-155对鼻咽癌上皮细胞CNE2Z增殖的影响 与NC组相比，miR-155 inhibitor组细胞增殖能力明显降低(P<0.05)，与miR-155 inhibitor组相比，miR-155 minics组细胞增殖能力显著上升(P<0.05，见表1，图1)。

表1 miR-155对鼻咽癌上皮细胞增殖的影响

*：与NC组相比， P<0.05；#：与miR-155 minics组相比，P<0.05。图1 miR-155对鼻咽癌上皮细胞增殖的影响

2.3 miR-155对鼻咽癌上皮细胞凋亡的影响 NC组、miR-155 minics组和miR-155 inhibitor组细胞凋亡率分别为(14.19±2.07)%、(6.27±0.94)%和(27.53±4.75)%，miR-155 inhibitor组细胞凋亡率显著高于与NC组(P<0.05)，miR-155 minics组细胞凋亡率明显低于miR-155 inhibitor组(P<0.05，见图2)。

2.4 miR-155对FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影响 miR-155 inhibitor组FSTL1蛋白水平明显高于NC组(P<0.05)，miR-155 minics组FSTL1蛋白水平显著低于miR-155 inhibitor组(P<0.05)；miR-155 inhibitor组C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明显低于NC组(P<0.05)，miR-155 minics组C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平显著高于miR-155 inhibitor组(P<0.05，见表2，图3)。

A：NC；B：miR-155 minics；C：miR-155 inhibitor。图2 miR-155对鼻咽癌上皮细胞凋亡的影响

表2 miR-155对FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影响

图3 miR-155对FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影响

2.5 FSTL1的表达对免疫功能的影响 对照组和FSTL1组中的ITCH蛋白表达分别为3.46±0.69和1.22±0.37，FSTL1组中ITCH蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)；对照组和FSTL1组中的MAVS蛋白表达分别为1.06±0.21和2.75±0.48，FSTL1组中MAVS蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)；对照组和FSTL1组中IFNγ水平分别为(25.79±7.84)ng/mL和(136.19±22.63)ng/mL，FSTL1组中IFNγ水平明显高于对照组(P<0.05，见图4)。

图4 ITCH、MAVS和IFNγ蛋白的表达

3 讨论

鼻咽癌是鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，发病率和死亡率位于头颈部恶性肿瘤之首[8]。目前认为鼻咽癌的发病原因可能与遗传因素、环境因素以及病毒因素具有一定的关系[9]，但鼻咽癌病理至今尚无定论。鼻咽周围遍布重要器官和神经，因为该病具有解剖结构的特殊性，所以鼻咽癌发生局部浸润生长就不宜进行手术治疗[10]。目前对于鼻咽癌的治疗，临床仍然首先为放疗，其次是化疗。新型生物的治疗在鼻咽癌治疗方面发挥着重要作用，以放疗为主的综合治疗是局部中晚期鼻咽癌比较标准的治疗手段[11]，尽管随着医疗水平的不断进步，放疗技术虽然有了突出性改变，但鼻咽癌的复发率和转移率依旧是临床上面临的严峻问题。

miRNA属于非编码RNA，在各种生物学行中发挥着重要的调节作用。miRNAs是调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中的关键基因，包括鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、非小细胞癌、胃癌等多种癌症细胞的周期、增殖、侵袭的过程中发挥着主要作用[12]。相关研究表明，miR-106b和miR-17等与鼻咽癌的预后密切相关[13-14]。也有研究报道，MiR-20b-5p与前列腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌多种肿瘤发生发展相关[15]。基于此，本研究探讨miR-155对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的作用，以及与FSTL1基因的相关性和对免疫逃避的作用。本研究结果显示，miR-155 mRNA在正常鼻咽上皮细胞NP69中低表达，在鼻咽癌上皮细胞系中呈现高表达；FSTL1 mRNA在正常鼻咽上皮细胞NP69中高表达，在鼻咽癌上皮细胞系中呈现低表达。通过CCK-8检测发现，抑制miR-155表达，鼻咽上皮细胞增殖能力显著降低，过表达miR-155，鼻咽上皮细胞增殖能力明显上升。为了进一步验证miR-155在鼻咽上皮细胞的作用，我们进一步采用流式细胞术检测鼻咽上皮细胞的凋亡能力，结果发现，抑制miR-155表达，鼻咽上皮细胞的凋亡能力明显增加，过表达miR-155，鼻咽上皮细胞凋亡能力显著降低，说明miR-155通过调控鼻咽上皮细胞增殖和凋亡来影响肿瘤的发生和发展。相关研究显示，miR-155在人鼻咽癌组织与细胞中高表达，抑制其表达，可抑制鼻咽癌细胞的增殖，其对于鼻咽癌的治疗具有重要意义[16]，与本研究结果类似。

FSTL1基因属于SPARC家族蛋白，是由基质细胞等多种细胞表达分泌，可以主动调节免疫细胞功能，发挥着促进或者抑制炎症的作用[17]。许多肿瘤都是由于慢性炎症刺激引起的，肿瘤的炎症微环境是肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和迁移的主要因素[18]。同时，许多先天免疫系统的信号分子也是被肿瘤细胞招募的，所以推测FSTL1在肿瘤的发生和发展过程中起着抑癌或者促癌的作用。为了进一步验证miR-155与FSTL1的相关性，本研究通过双荧光素酶报告实验结果显示，过表达miR-155野生型FSTL1基因的荧光素酶活性明显增强；且抑制miR-155的表达，FSTL1蛋白水平明显升高，C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明显降低。过表达miR-155， FSTL1蛋白水平显著降低，C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明显升高。所以说，miR-155可能通过靶向FSTL1基因发挥着对鼻咽癌细胞的增殖、凋亡作用。相关研究报道，miR-155通过靶向PTEN-PI3 KAKT信号通路，发挥促进鼻咽癌细胞增殖以及抑制鼻咽癌细胞凋亡的作用，为治疗鼻咽癌提供新的靶点[19]。

在肿瘤的发展过程中，宿主免疫系统和肿瘤细胞相互影响，相互制约。在正常生理状态下，宿主免疫系统起着免疫监控的作用，能够识别肿瘤细胞的非己抗原，产生免疫应答，抑制肿瘤细胞，从而阻止肿瘤的发展。于此同时，肿瘤也可以通过多种路径逃避机体的免疫监控作用，使肿瘤细胞得以繁衍和发展，即发生肿瘤的免疫逃避现象[20]。肿瘤免疫治疗目前发展比较迅速，相关研究表明，鼻咽癌可通过下调FSTL1蛋白的旁分泌抑制巨噬细胞的免疫功能，从而使肿瘤细胞能够逃避机体免疫细胞杀伤作用[21]。免疫系统在杀伤有害物质的同时，也需要保证正常的细胞不受侵害，所以机体必须保持动态的免疫平衡，预防疾病的发生。ITCH通过调节T细胞内信号通路诱导机体免疫耐受[22]，相关研究表明，沉默ITCH基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞 LA795 的体外免疫杀伤效率[23]。MAVS 通过核基因组进行编码，在抗病毒免疫通路中扮演不同的角色，为了维持抗病毒天然免疫的平衡，MAVS 在病毒感染的后期会逐渐降解[24]。IFNγ是Th1 细胞的代表因子,具有干扰病毒复制的作用[25]。本研究结果显示，诱导FSTL1后的鼻咽癌细胞中ITCH蛋白表达明显降低，MAVS蛋白表达和IFNγ水平的表达显著升高。

综上所述，抑制miR-155表达能够降低鼻咽癌细胞的增殖能力，促进鼻咽癌细胞凋亡，miR-155可能通过诱导FSTL1基因参与鼻咽癌的调控，同时通过诱导FSTL1基因，降低鼻咽癌细胞中ITCH表达，增加MAVS和IFNγ表达量，达到机体内动态的免疫平衡。