油炸薯片中羧甲基赖氨酸形成规律及抑制作用的研究

韩文凤 周迎春 谭兴和

(浙江工业职业技术学院鉴湖学院1, 绍兴 312000)(中华人民共和国漯河海关2，漯河 462000)(湖南农业大学食品科技学院3，长沙 410128)

食品热加工过程中的美拉德反应在赋予其良好色香味的同时，也会生成包括羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyllysine，CML)、羧乙基赖氨酸(Nε-carboxyethyllysine，CEL)、吡咯素(Pyrraline，PY)、戊糖苷素(Pentosidine，PE)、咪唑赖氨酸(Imidazolysine，IM)和交联素(Crosslines，CR)等在内的20多种晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End-products，AGEs)。CML是第一个被分离鉴定出来的AGEs化合物，同时也是存在于食品中的最为主要的一种AGEs[1]。CML与许多疾病的发生密切相关，能促使糖尿病、关节炎和动脉粥样硬化等疾病的发展和人体器官的快速衰老[2,3,4]。周燕琼[5]发现油炸香蕉片的CML含量为3.9 mg/kg，紫薯片的CML含量为5.1 mg/kg，而油炸马铃薯片中CML含量可达22.2 mg/kg，可见油炸薯片中CML的含量比同类食品要高。油炸薯片中高含量CML的存在给马铃薯产业蒙上了巨大的阴影，也对消费者的健康构成威胁，成为当今食品安全领域亟待攻克的一大难题。

水果多酚作为一种具有抗氧化活性的天然化合物，已越来越多的引起了人们的关注。水果多酚是存在于水果中的多羟基酚类化合物的总称，主要存在于水果的果皮、果肉及果核中，含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素[6]。水果多酚中的酚羟基很容易与环境中的氧结合，被氧化成醌类结构，这使水果多酚具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力。刘慧琳等[7]研究发现白黎芦醇、原花青素和绿原酸等6种多酚类化合物对饼干中CML均具有一定的抑制作用。Zhang等[8]研究发现当把柚皮素、表儿茶素和绿原酸等多酚单体添加到葡萄糖-酪蛋白糖基化模型中以120.0 ℃加热2.0 h后，检测发现这些多酚类化合物能够抑制CML等AGEs的形成。刘荟萃等[9]发现槲皮素、芦丁和表儿茶素对牛血清蛋白-果糖模拟反应体系中CML等AGEs具有抑制作用。李书艺等[10]研究发现荔枝果皮原花青素能够抑制乳清蛋白-葡萄糖和牛血清白蛋白-葡萄糖模拟生理体系中的CML等AGEs的形成。周凯文等[11]研究发现茶多酚和木犀草素对CML的抑制率分别为13.67%和16.52%。前人的研究结果证明多酚单体对CML具有较好的抑制作用。但是由于多酚单体的制取工艺复杂，导致价格较高，很难实际应用到食品生产中去。

葡萄籽、苹果皮和山楂皮通常是食品工业的下脚料，但其中含有丰富的以绿原酸、槲皮素和儿茶素等为代表的多酚类化合物，以这类原料提取得到的多酚类物质同样对CML具有良好的抑制作用，并且具有来源广泛和价格便宜的优点，适于在食品生产中应用。油炸薯片按原料来源的不同，可分为油炸复合薯片和油炸鲜切薯片，为了保证实验条件的一致性和可操作性，本文以油炸复合薯片(简称油炸薯片)为研究对象，研究了其不同工艺条件下CML的形成规律，及葡萄籽、苹果皮和山楂皮多酚对CML的抑制作用效果，同时结合水果多酚对油炸薯片感官品质的影响，来探讨水果多酚用于抑制CML形成的可行性，以期为降低油炸薯片中CML的含量提供解决方案。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

马铃薯全粉、棕榈油、葡萄籽多酚(多酚含量99.4%)、苹果皮多酚(多酚含量70.1%)、山楂皮多酚(多酚含量80.0%)；CML标准品(纯度为98.0%)、CML-D4同位素内标(化学纯度为98.0%，同位素纯度为97.9%)；乙腈(质谱纯)、甲酸(质谱纯)；其他试剂等级均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

VacElut SPS 24 真空固相萃取装置，N-EVAP-24圆形水浴氮吹仪，ACQUITY超高效液相色谱仪，XEVO TQ三重四级杆串联质谱仪，ACQUITY BEH Amide HILIC柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，ACQUITY BEH Amide Vanguard保护柱(1.7 μm)，Milli-Q Advantage A10 超纯水系统。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

配制浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列CML标准溶液，每个浓度梯度中氘代羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyllysine-D4，CML-D4)内标液的浓度均为10.0 ng/mL，涡旋均匀，在UPLC-MS/MS系统中分析测定CML的含量。以响应值[CML-D4浓度×(CML峰面积/CML-D4峰面积)]Y和CML浓度X分别为纵坐标和横坐标，绘制内标法CML的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。

1.3.2 检测方法的验证

通过计算检出限(Limit of Detection，LOD)、定量限(Limit of Quantification，LOQ)和准确度来评价检测方法的可行性。待测物的信号强度(Signal intensity，S)与基线噪音(Noise，N)的比值称为信噪比(S/N)。一般将LOD定义为S/N=3也就是峰高是基线噪音高的3倍时的浓度[12]。将LOQ定义为S/N=10也就是峰高是基线噪音高的10倍时的浓度[13]。一般以标准曲线中最低浓度离子峰图的S/N值为基准来计算LOD和LOQ。其S/N即峰高是基线噪音高的X倍时，则检出限D=3C/X；式中：C代表待测物浓度，X代表信噪比，D代表LOD。定量限Q=10C/X；式中：C代表待测物浓度，X代表信噪比，Q代表LOQ。

将薯片(180 ℃下油炸120 s)样品进行加标实验，加标量分别为5.0、10.0、20.0 μg/g，每个加标浓度均做6份平行实验，计算各加标水平的平均回收率见公式1。

(1)

式中：P为加标回收率；C2为样品中加入CML标准品后的实测值；C1为样品本身的CML含量；C0为样品加入的标准品量。

1.3.3 油炸薯片的制备

以马铃薯全粉为原料，按马铃薯全粉与水的质量比为1∶1的比例，搅拌均匀并揉搓制成湿面团后，擀成厚度为1.0 cm面片，用蒸汽加热处理10.0 min。将蒸熟的面团冷却到40.0 ℃，搓成直径为4.0 cm的面柱。将面柱装入保鲜袋中，密封后置于4.0 ℃条件下冷却老化8.0 h。将充分老化的面柱切成1.5 mm厚的薄片，以(50.0±3.0)g为一批，置于常压条件下的棕榈油中炸制(140.0 ℃下分别油炸40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0 s；180.0 ℃下分别油炸40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0 s；220.0 ℃下分别油炸40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0 s)。将经油炸后的薯片捞出控油，在室温下冷却60.0 min，取一部分样品充分研磨至粒径约为0.5 mm的粉末。将油炸薯片样品和油炸薯片粉末分别放入密封袋(未粉碎的样品用于感官评价，粉碎的样品用于检测其中CML的含量)，于-20.0 ℃冰箱中储存备用。

1.3.4 基于水果多酚的油炸薯片的制备

分别称取葡萄籽多酚、苹果皮多酚和山楂皮多酚各0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00 g加入到50.0 g水中配制成水溶液。按照水与马铃薯全粉质量比为1∶1的比例，使水果多酚添加量分别占面团总质量的0.01%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%、1.00%、2.00%。搅拌均匀并揉搓制成湿面团后，擀成厚度为1.0 cm面片，用蒸汽加热处理10.0 min。蒸熟的面团冷却到40.0 ℃，搓成直径为4.0 cm的面柱。将面柱装入保鲜袋中，密封后置于4.0 ℃条件下冷却老化8.0 h。将充分老化的面柱切成1.5 mm厚的薄片，以(50.0±3.0) g为一批，置于常压180.0 ℃的棕榈油中炸制120.0 s。将经油炸后的薯片捞出控油，在室温下冷却60.0 min，取一部分样品充分研磨至粒径约为0.5 mm的粉末。将油炸薯片样品和油炸薯片粉末分别放入密封袋(未粉碎的样品用于感官评价，粉碎的样品用于检测其中CML的含量)，于-20.0 ℃冰箱中储存备用。同时以未加水果多酚组作为空白对照实验。

CML抑制率的计算公式为：

(2)

1.3.5 感官评价方法

感官品质评价是一种能真实客观反映食品品质的有效方法，在国内外食品科学研究中得到广泛的应用，目前尚无任何一种仪器测试能完全取代感官评价。本试验中抽取10名经过专业训练并有感官评价经验的人员组成评价小组，在专业感官品质评价室内，从色泽、质地、滋味与气味3个方面按规定的评分标准对油炸薯片样品进行结构化评价，综合评分为品评人员对样品的总体接受度。评分标准如表1。

表1 感官评定标准

1.3.6 样品的预处理

称取0.10 g(精确至1.0 mg)粉粹后的油炸薯片，向样品中加入正己烷脱脂，充分涡旋混匀后，离心弃去正己烷层。将脱脂所得的样品水解后离心，上清液定容至25 mL。定容后的溶液用滤纸过滤1次，以除去颗粒较大的杂质。采用MCX固相萃取柱对样品进行净化，以CML-D4为同位素内标在UPLC-MS/MS系统中分析测定CML的含量[14]。

1.3.7 UPLC-MS/MS检测条件

1.3.7.1 液相色谱条件

仪器：ACQUITY超高效液相色谱仪；色谱柱：ACQUITY BEH Amide HILIC柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；保护柱：ACQUITY BEH Amide Vanguard柱(1.7 μm)；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；运行时间：7.0 min；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；进行梯度洗脱，洗脱参数如表2。

表2 梯度洗脱参数

1.3.7.2 质谱条件

仪器：XEVO TQ三重四级杆串联质谱仪；离子源模式：ESI+；监测模式：MRM；毛细管电压：3.5 kV；锥孔电压：20 V；碰撞能量：15 V；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流速：700 L/h；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气和锥孔气体为氮气；碰撞气体为氩气；MRM模式的设置：CMLm/z205.22～84.00定量，m/z205.22～130.00定性；CML-D4m/z209.00～87.70定性。

1.4 统计学数据分析方法

每个样品做3份平行实验，数据以“平均值±标准偏差”的方式表示，采用SPSS Statistics 17.0中单因素方差分析ANOVA的Dunnett's T3方法对实验数据的显著性进行检验。P<0.05时表示对比的数据间具有显著差异，P≥0.05时表示对比的数据间差异不显著。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以响应值Y和CML浓度X分别为纵坐标和横坐标，绘制CML的内标法标准曲线,并计算回归方程和相关系数分别为：Y=2.435 9X-1.183 1，R2=0.998 9，CML线性范围为1.0～50.0 ng/mL。图1为CML总离子流图，CML的出峰时间为4.68 min, 图2为CML和CML-D4的一级质谱图，图3为CML和CML-D4的二级质谱图。CML的定量子离子的m/z为84.00，定性子离子的m/z为130.00。

图1 CML总离子流图

图2 CML和CML-D4的一级质谱图

图3 CML和CML-D4的二级质谱图

2.2 检测方法的验证

通过UPLC-MS/MS工作软件对标准曲线中最低浓度(1.0 ng/mL)的CML离子流图谱进行自动分析获得S/N(X)=78.83。由检出限D=3C/X，定量限Q=10C/X，计算得出该检测方法中CML的LOD约为0.038 ng/mL，LOQ约为0.127 ng/mL；CML的加标回收率为82.18%～91.85%。对于方法学验证中的准确度而言，通常可以接受的回收率范围为80.0%～120.0%[15]，说明本方法的回收率在可接受的范围内。可以看出本方法具有较高的准确度和灵敏度，可以用于油炸薯片中CML的定量检测。

2.3 油炸工艺条件对薯片中CML含量的影响

从图4中可以看出，在油炸时间为40.0～240.0 s的范围内，薯片于140.0 ℃的较低温度下油炸，其中CML的含量随油炸时间的延长而逐步上升。于180.0 ℃的温度下油炸，其中CML的含量随油炸时间的延长呈先增加后降低的趋势，在120.0 s时CML含量为(11.70±0.19) μg/g，在160.0 s时CML含量达到(11.86±0.15)μg/g。120.0 s和160.0 s时样品中CML的含量属于3组数据中最高的2个，两者之间没有显著差异(P≥0.05)。于220 ℃的高温下油炸，其中CML的含量随油炸时间的延长也呈先增加后降低的趋势，在80.0 s时CML含量达到最大值(10.99±0.15) μg/g。同时还可以看出，薯片中CML的含量在220 ℃油炸时比180 ℃下降速度快很多。CML是还原糖和蛋白质进行美拉德反应的中间产物，在美拉德反应中CML的形成和分解是同时存在的，高温下更利于CML的分解[14]。在油炸高温反应的初期，反应底物充足，CML的形成速率大于分解速率，CML含量不断增加。随着反应的进行，CML形成所需的反应底物减少，CML分解速率逐渐超过形成速率，CML含量也呈现下降趋势[16]。

注：图中同一条曲线中不同字母表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母表示数据差异不显著(P≥0.05)，余同。图4 油炸工艺条件对薯片中CML含量的影响

2.4 不同油炸条件薯片的感官评价及其与CML含量的关系

从表3可以看出，在油炸时间为40.0～240.0 s

表3 不同油炸条件的薯片感官评价结果

的范围内，薯片于140.0 ℃的较低温度下油炸，其各项感官评价得分随油炸时间的延长而分值升高，并且各感官评价得分数据间有显著差异(P<0.05)；从图4可以看出，薯片中CML的含量也随油炸时间的延长而升高。于180.0 ℃的温度下油炸，其各项感官评价得分随油炸时间的延长呈先升高再降低的趋势。120.0 s时的感官综合评分为(9.28±0.11)分，160.0 s时的为(9.20±0.12)分，感官综合评分是3组数据中最高的2个，两者之间没有显著差异(P≥0.05)；薯片中CML的含量也呈先升高再降低的趋势，120.0 s时的CML含量为(11.70±0.19)μg/g，160.0 s时的CML含量为(11.86±0.15)μg/g，也是属于3组数据中最高的2个，两者之间没有显著差异(P≥0.05)。于220 ℃的高温下油炸，其各项感官评价得分和样品中CML的含量均随油炸时间的延长呈先升高再降低的趋势，但220 ℃时的下降速度比180 ℃时的更快。

对140、180、220 ℃的油炸薯片的感官综合评分与CML含量之间进行相关性分析，其相关性系数R2分别为0.973 2、0.933 5和0.948 2，如图5所示。结合表3可以看出两者之间呈高度正相关，也就是说油炸薯片的感官综合评分较高时，CML含量也相应较高。3组实验数据中，在油炸温度为180.0 ℃和时间分别为120.0 s和160.0 s时，油炸薯片的感官综合评分属于3组数据中最高的2个，数据间没有显著差异(P≥0.05)，样品中CML的含量也是属于3组数据中最高的2个，数据间没有显著差异(P≥0.05)。综合考虑各因素后，选用油炸温度为180.0 ℃和时间为120.0 s的工艺条件，来研究水果多酚对油炸薯片中CML的抑制作用效果。

图5 油炸薯片的感官综合评分与CML含量相关性的散点图

2.5 水果多酚对油炸薯片中CML含量的影响

从图6中可以看出，3种水果多酚对油炸薯片中CML的形成均有不同程度的抑制作用，并且CML抑制率均随添加量的增加而增大。水果多酚添加量在0.01%～1.00%范围内增加时，抑制率增加较快，当水果多酚添加量超过1.00%后继续增加时，抑制率增加较慢。统计学分析表明在水果多酚添加量小于1.00%时，同一组各数据间呈显著差异(P<0.05)；

但当水果多酚添加量大于1.00%时，CML的抑制率随添加量的增速变小，各数据间差异不显著(P≥0.05)。这是因为薯片的油炸工艺条件不变时，参与CML抑制反应的水果多酚单体总量一定的，添加量超过一定范围后，CML抑制率变化不大。

以上分析证明葡萄籽、苹果皮和山楂皮中的多酚类有效成分，对油炸薯片中CML的形成具有一定的抑制作用，并且在0.01%～2.00%的添加量范围内，CML的抑制率随水果多酚添加量的增加而增大，水果多酚添加量和CML的抑制率之间存在显著的量效关系。不同水果多酚对CML抑制率产生差异的原因主要有以下两方面：首先是水果多酚的成分不同；葡萄籽多酚的主要成分为儿茶素类、原花青素和槲皮苷等，这些多酚类物质中的酚羟基含量丰富。其次是水果多酚中有效成分的含量也有差异；葡萄籽多酚中的多酚类物质有效成分的含量达99.4%，而苹果皮多酚和山楂皮多酚中的有效成分的含量则相对较低。

注：图中同组不同字母表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母表示数据差异不显著(P≥0.05)图6 水果多酚对油炸薯片中CML的抑制作用

2.6 添加水果多酚的油炸薯片感官评价及其与CML抑制率的关系

从表4可以看出，葡萄籽多酚在添加量为0.01%和0.05%时，其色泽评分与空白对照组相比没有显著差异(P≥0.05)；苹果皮多酚和山楂皮多酚在添加量为0.01%、0.05%和0.10%时，其色泽评分与空白对照组相比没有显著差异(P≥0.05)。其他较高添加量的色泽评分与空白对照组相比均差异显著(P<0.05)，并且色泽评分随水果多酚添加量的增加而降低。说明较低的添加量对油炸薯片的色泽几乎没有影响，较高的添加量对色泽有显著的影响。章宇[17]也发现采用0.1%和0.5%的竹叶黄酮类多酚浸渍处理薯片，油炸后的色泽评分较低，分析是竹叶黄酮本身色泽带入的影响。因为多酚类物质一般为棕黄色粉末，高温下也不会褪色。质地和滋味与气味项目的得分与空白对照组相比均没有显著差异(P≥0.05)，说明添加水果多酚对油炸薯片的质地和滋味与气味基本无影响。

表4 添加不同水果多酚的油炸薯片感官评价结果

对添加葡萄籽、苹果皮或山楂皮多酚的油炸薯片的色泽评分与CML抑制率之间进行相关性分析，其相关性系数R2分别为0.922 3、0.844 2、0.924 6，如图7所示。结合表4可以看出两者之间呈高度负相关，也就是说CML的抑制率增大时，色泽评分会降低。而CML抑制率与油炸薯片的质地、滋味与气味没有相关性。

图7 油炸薯片的色泽评分与CML含量相关性的散点图

3 结论

本研究分析了不同工艺条件下油炸薯片中CML的形成规律，结果表明在时间为40.0～240.0 s的范围内，薯片在140.0 ℃的较低温度下油炸，其中CML的含量随油炸时间的延长而逐步上升；在180.0 ℃和220 ℃的温度下油炸，CML的含量随油炸时间的延长呈先增加后降低的趋势；同时还可以看出，油炸薯片中CML的含量在220 ℃油炸时比180 ℃下降速度快很多。油炸薯片的感官综合评分与CML的含量呈高度正相关，当CML的含量较高时感官综合评分的相应较高。薯片中分别添加0.01%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%、1.00%、2.00%的葡萄籽、苹果皮或山楂皮多酚时，CML抑制率均随水果多酚添加量的增加而增大。在感官指标方面，较低添加量的水果多酚对油炸薯片的色泽几乎没有影响，较高添加量会使色泽评分显著降低；对质地、滋味与气味基本无影响。CML抑制率与油炸薯片的色泽评分高度负相关，CML抑制率增大时，色泽评分会降低；而与质地、滋味与气味没有相关性。得出生产低CML含量油炸薯片的关键工艺条件为，葡萄籽、苹果皮和山楂皮多酚的添加量分别为0.05%、0.10%和0.10%，以(50.0±3.0) g为一批，常压下置于温度为180.0 ℃的棕榈油中油炸120.0 s，CML的抑制率分别为(25.22±0.50)%、(26.65±0.53)%和(18.66±0.32)%，并且不影响其色泽、质地、滋味与气味。