高压静电场处理对甘薯采后愈伤的促进效应

成纪予 舒志建 金佳平 路兴花 陆国权 庞林江

(浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，杭州 311300)

甘薯皮薄质嫩，含水量高，不耐贮藏，在采收和贮运中易受到机械损伤，而损伤是造成甘薯采后损耗的主要因素。高温处理(29～38 ℃)可有效促进甘薯采后愈伤[1]，但贮存空间、能源消耗及经济投入大[2]。据报道，外源乙烯、一氧化氮、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、苯丙氨酸、壳聚糖、水杨酸(SA)、苯丙噻重氮(BTH)等化学物质处理能提高采后马铃薯或甘薯的苯丙烷代谢[3-7]，促进代谢产物木质素的积累，具有加快愈伤效果，但化学方法具有操作不便、潜在危害和环境污染等缺点，在实际应用上会受到较大的限制。因此，研究与开发新型实用的甘薯愈伤技术对于促进甘薯采后愈伤效果，提高耐贮性和贮藏品质具有重要意义。

高压静电场属于电磁微能，作为一种物理技术，具有操作简便、无毒无害、对环境无残留无污染等优点，可用于食品保鲜领域[8]。空间磁场的改变会造成植物体的细胞分裂[9]、细胞增殖[10]、基因表达[11]、抗病性[12]及酶活性[13]等方面发生变化。丹阳等[14]研究发现短时间的高压静电场处理可以抑制黄瓜细胞膜透率的上升；曹学成等[15]表明高压静电场处理能够提高黄瓜种子中过氧化氢酶(CAT)的活性，清除细胞内多余的H2O2，减轻由氧化带来的伤害；赵剑等[16]认为静电场预处理大豆种子可以修复膜损伤部位。高压静电场对海棠[17]、烟草[18]、银杏[19]等愈伤组织的生长和再分化具有促进作用。可见，施加高压静电场可以调控植物生理代谢，但是，不同的高压静电场处理参数对生物体的作用效应影响各异。

本研究以‘心香’甘薯为材料，进行人工机械损伤，通过单因素和响应面法优化高压静电场愈伤条件，以木质素含量为考察指标，建立可信的数学模型，获得电场促进甘薯愈伤的最佳电场强度、处理时间及处理温度参数；并监测电场处理对损伤甘薯愈伤效率的影响程度。以期为高压静电场在甘薯采后愈伤和贮藏保鲜中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜食型甘薯品种：心香。挑选无机械损伤、无病虫害、无发芽霉变、大小均匀(单个质量约50 g)的薯块为实验材料。无水乙醇、盐酸、硫酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氢氧化钠，均为分析纯。

1.2 仪器设备

HWS-250FT智能恒温恒湿实验箱(控温范围0～50 ℃，精度为±0.5 ℃；控湿范围50%～90%RH，精度为±2%；外形尺寸为550 mm×610 mm×1 760 mm)。高压静电场发生仪(包含主机和2块发射板，实验时将电场发射板平行安装于智能恒温恒湿实验箱的顶部和底部，两块发射板间距离可调，可形成30～1 500 kV/m的负高压静电场)，T6新世纪紫外可见分光光度计，DGG-9053AD电热恒温鼓风干燥箱，3K15型离心机，KQ 5200B型超声波清洗器，BCD-212(KK21E68T1)冰箱。

1.3 处理方法

1.3.1 甘薯人工损伤处理

将甘薯用浓度为0.2%的次氯酸钠溶液清洗消毒，自然晾干后随机分组，每组30个甘薯，甘薯的损伤方式为沿着赤道横向切开两半[20]。在愈伤过程中甘薯的摆放呈平铺无堆叠的状态，以保证温度的均匀分布和各个样品的受热均匀性。

1.3.2 高压静电场处理单因素实验

以电场强度、处理时间和处理温度为考察因素，用木质素含量评价高压静电场处理对甘薯愈伤的影响。

电场强度对甘薯愈伤的影响：将人工损伤后甘薯分别置于0、200、400、600、800、1 000 kV/m电场环境中作用8 h，作用温度25 ℃，RH为85%～90%，在愈伤第4天取出检测，筛选出较适宜的电场施加强度。同时与常规的高温愈伤处理(35 ℃，RH为85%～90%作对比。

处理时间对甘薯愈伤的影响：将人工损伤后甘薯在25 ℃、RH为85%～90%、800 kV/m的电场环境中分别作用4、8、12、16、20 h，在愈伤第4天取出检测，筛选出较适宜的电场处理时间。

处理温度对甘薯愈伤的影响：将人工损伤后甘薯分别置于10、15、20、25、30、35 ℃的800 KV/m电场环境中作用12 h，在愈伤第4 d取出检测，筛选出较适宜的电场处理温度。

1.3.3 高压静电场处理响应面优化

在单因素基础上，根据Box-behnken实验设计原理，进行响应面优化，以木质素含量为指标，考察电场强度、处理时间及处理温度对甘薯愈伤效应的影响，因素与水平见表1。

表1 响应面实验设计因素与水平表

1.4 测定方法

1.4.1 木质素含量

愈伤后用切取甘薯伤口部位及皮下3 mm厚的薯肉组织用于木质素含量检测。称取5.0 g甘薯样品M0与15 mL 72% H2SO4于25 ℃静置1 h，再加345 mL蒸馏水将硫酸浓度稀释至3%，100 ℃水浴回流3 h后过滤悬浮液，并用50 ℃左右的温水将木质素连同滤纸M1一起洗涤至中性，将木质素连同滤纸一并移入称量瓶，105 ℃烘干至恒重M2。计算公式为：木质素质量分数=(M2-M1)/M0×100%。

1.4.2 间苯三酚染色

在甘薯伤口表面滴加2～3滴1 mol/L盐酸，然后滴加2～3滴5%～10%间苯三酚的85%酒精溶液，根据染色区域和颜色深浅检验愈伤程度[7]。

1.4.3 相对电导率

切取相同甘薯愈伤部位圆片(直径×厚度，Ф20 mm×2 mm)，在50 mL去离子水中轻微振荡3 h，测定并记录电导率P1，然后沸水水浴30 min，冷却后测定并记录电导率P2[21]。计算公式为：相对电导率=P1/P2×100%。

1.4.4 丙二醛(MDA)含量

取样方法与木质素含量检测一致。称取1.0 g甘薯样品与5 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液，充分研磨成匀浆，于4 ℃、10 000×g离心15 min，收集上清液备用。取1 mL上清液，加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混匀并煮沸30 min，冷却后取上清液分别在532、600、450 nm测定吸光值[21]。上清液MDA含量计算公式为：MDA含量(μmol/L)=6.45×(OD532 nm-OD600 nm)，再计算出愈伤组织样品的MDA含量，单位以μmol/gFW计。

1.5 数据处理

实验重复3次，实验结果以平均值±SD表示。采用OriginPro 2018软件绘图；用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析，数据统计采用Duncan’s统计分析，P<0.05表明差异显著，P<0.01表示差异极显著；用Design-Expert 8.0软件进行响应面设计与方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 电场强度对甘薯愈伤的影响

木质素是创伤次生周皮的主要组成物质，其含量的合成和积累反映植物细胞壁木质化的进程[22]。由图1可知，不同强度的高压静电场处理对甘薯损伤部位木质素含量的影响不同， 0～800 kV/m木质素含量随电场强度的增大而升高，800～1 000 kV/m木质素含量反而略有降低，这可能是因为过强的电场处理反而削弱木质素的合成代谢。800 kV/m电场强度下，甘薯损伤部位的木质素含量显著高于其他处理组(P<0.05)，表明常温下电场强度达800 kV/m时利于甘薯的愈伤，且较高温处理具有更好的愈伤效果。

2.1.2 处理时间对甘薯愈伤的影响

由图1可见，电场处理时间长短影响甘薯损伤部位木质素的合成量。从0～12 h，木质素含量随时间的增加而上升；从12～20 h，木质素含量随时间的增加略有下降，这说明过长的电场处理时间反而会减弱木质素的合成，推测可能是因为电场强度对木质素合成代谢相关酶活性的影响存在阈值，超过一定强度会改变相关酶的功能，导致木质素合成量减少，其具体机理有待更深入的研究。处理12 h时甘薯损伤部位的木质素含量显著高于其他处理组(P<0.05)，表明处理时间为12 h利于甘薯愈伤组织的形成。

2.1.3 处理温度对甘薯愈伤的影响

由图1可知，电场作用温度不同，甘薯损伤部位木质素的合成量亦有所不同。随温度增加，木质素含量呈先上升后下降的趋势。10～25 ℃木质素含量显著增加(P<0.05)，25～35 ℃的电场作用下，木质素含量显著降低(P<0.05)，推断可能是温度过高会导致合成木质素的一些酚类前体物质氧化速度加快，从而造成合成量减少。25 ℃下电场处理甘薯愈伤部位的木质素含量最高，且与其他温度下处理均差异显著(P<0.05)，表明处理温度为25 ℃时利于甘薯愈伤组织的形成。

注：图中相同字母表示不同条件之间无显著性差异(P>0.05)；不同字母表示不同条件之间有显著性差异(P<0.05)。图1 不同处理条件下甘薯愈伤部位的木质素含量

2.2 响应面优化结果

响应面分析方案及结果如表2所示。通过多元回归拟合，得到木质素含量对电场强度(A)、作用时间(B)和作用温度(C)的二次多项回归模型为：y=4.62+0.11A-0.45B+0.59C+0.17AB+0.082AC-0.24BC-0.66A2-0.53B2-1.12C2。由表3可知，该模型极显著(P<0.001)，方程失拟项不显著(P>0.05)，且实验模型的决定系数RAdj2为0.950 6，说明该模型拟合程度较好，可用于高压静电场促进甘薯的愈伤处理条件的分析与预测。

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归模型方差分析

由表4可知，模型一次项A差异不显著，B和C差异极显著(P<0.01)；交互项AB和BC差异显著，AC差异不显著；二次项A2、B2和C2差异均极显著。各因素的主效应关系为：处理温度>处理时间>电场强度。由回归方程模型分析各因素间与响应值的交互效应，结果显示三者两两交互作用响应面曲线图均为球形，等高线均为椭圆性，反映三因素两两交互作用明显，且电场强度、处理时间及处理温度的增加到一定程度时，木质素含量反而降低，说明高压静电场施加作用过于强烈反而不利于甘薯愈伤组织的形成。

表4 回归模型系数显著性检验表

结合二次回归模型的分析结果，得到高压静电场促进甘薯愈伤的最佳处理参数为：电场强度为808.5 kV/m、处理时间为10.1 h、作用温度为26.6 ℃，在此条件下获得甘薯损伤部位木质素质量分数的理论值为4.83%。为检验优化结果的可靠性，同时考虑实际操作方便性，将各参数修正为：电场强度为800 kV/m、处理时间为10.0 h、作用温度为26.0 ℃，在此条件下进行愈伤处理，木质素质量分数为4.82%，与理论值仅相差0.2%，说明该模型可靠，经优化得到的电场处理条件可靠。

2.3 电场处理对甘薯愈伤的促进作用

2.3.1 间苯二酚染色情况

间苯三酚染色染色区域越大、颜色越深表明甘薯切面愈合程度越高[23]。染色结果显示，愈伤期间，静电场处理和高温处理组的甘薯切口处染色后颜色均比对照处理组的深，愈伤4 d后，甘薯切面伤口愈合程度明显好于对照组。在愈伤1、2 d，静电场处理组甘薯伤口处的染色深度和染色面积均比高温处理组更为明显，反映出愈伤前期静电场处理更快地诱导木质素的生成。

2.3.2 相对电导率的变化

细胞膜透性是评价细胞组织完整性的重要指标[24]，细胞膜透性的大小可用相对电导率衡量；相对电导率越大，表示电解质的渗透量越多，细胞膜完整性遭到破坏的程度就越大。由图2可知，甘薯切口部位的相对电导率总体呈上升的变化趋势，高温处理组和电场处理组的上升幅度与上升速度均显著低于对照组(P<0.05)。愈伤4 d后，高温处理组和电场处理组的甘薯细胞膜透率分别为4.0%和3.5%左右，显著低于对照组(P<0.05)，两组之间无显著性差异(P>0.05)。可见，高温处理和电场处理促进了伤口愈合的速度，从而大大减轻损伤给甘薯带来的细胞物质交换失衡现象，缓解细胞液渗漏现象。

注：图中相同字母表示同一时间下不同条件之间无显著性差异(P>0.05)；不同字母表示同一时间下不同条件之间有显著性差异(P<0.05),下同。图2 愈伤期间损伤甘薯相对电导率的变化

2.3.3 丙二醛含量的变化

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终产物，也是衡量细胞膜膜透性的重要指标之一[25]。由图3可知，机械损伤造成甘薯细胞结构的破坏，使得膜脂的过氧化作用加剧，MDA含量上升。甘薯损伤1 d时，对照组、高温处理组和电场处理组的MDA含量分别增加4.4倍、4.6倍和3.8倍，3个处理间无显著差异(P>0.05)。但随着愈伤时间延长，电场处理组的MDA含量则明显低于对照组和高温处理组(P<0.05)。对照组伤口愈合速度慢，使得受损细胞的膜脂过氧化作用时间也增加；而高温处理虽然伤口可以得到较好愈合，但是高温下会加速过氧化反应的速度。实验结果表明，电场处理能抑制因机械损伤导致的膜脂过氧化反应，减少膜脂过氧化物的积累，使MDA含量在愈伤期间维持在较低水平。

图3 愈伤期间损伤甘薯MDA含量变化情况

3 讨论

木质素作为植物细胞壁的主要成分之一，其含量高低反映细胞壁木质化程度，与植物抗病性密切相关[26]。综合本研究结果进行分析，不同电场愈伤条件对甘薯受损部位木质素的积累表现出不同的影响，电场强度为800 kV/m、处理时间为10.0 h和处理温度为26.0 ℃时表现出更高的木质素的生长速率和合成量，且对受损细胞膜的修复能力更为明显。通过外源处理促进愈伤组织的木质素大量积累，加速细胞壁木栓化，可以提高受损组织的愈伤效果，本研究与王连平等[4]研究结果相类似。丹阳等[27]、岑剑伟等[28]的研究也表明高压静电场处理能更好地维持黄瓜、罗非鱼贮藏期间细胞的完整性，减缓品质的劣变速度。因此，选择合适的高压静电场处理参数对提高甘薯采后愈伤效应具有重要意义。木质素的合成与植物体的苯丙烷代谢密切相关[29]，通过诱导调节苯丙烷代谢中PAL、C4H和4CL等关键酶的活性和基因表达，可增加木质素及其他抗菌物质的合成[30-32]，抑制病原菌侵染。已有研究表明一定剂量的高压静电场处理可提高植物组织的SOD酶活性、降低POD酶和IAA氧化酶活性，诱导植物愈伤组织的生长和形成[18，19]。由此，可推测高压静电场处理可能通过增强甘薯愈伤组织苯丙烷代谢促进木质素的沉积，但其对木质素积累的生物学调控机制尚不清楚，有待进一步研究。

4 结论

通过比较对照、高温处理与高压静电场处理对机械损伤甘薯切口部位木质素合成的影响，发现高压静电场处理具有促进甘薯采后愈伤的潜在效应。本实验在单因素实验的基础上，采用响应面法优化电场处理参数，探究适宜的电场强度、处理时间和处理温度，对促进甘薯采后愈伤作用具有指导意义。结果表明，高压静电场处理的最佳处理参数为：电场强度为800 kV/m、处理时间为10.0 h、作用温度为26.0 ℃，在此条件下进行愈伤处理，木质素合成含量较高。同时，在愈伤期间，高压静电场处理组受损薯块的相对电导率和MDA含量均低于对照组；且较高温处理相比，高压静电场处理作用下可降低膜脂过氧化程度。表明适宜的电场处理可在一定程度上减轻机械损伤对细胞组织带来的伤害，保护细胞膜的完整性，促进甘薯愈伤，从而增强甘薯贮藏期间的抗病性。