具有良好风味嗜热链球菌的筛选及其产香特性分析

丹 彤，乔少婷，田佳乐

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）作为酸奶的常用发酵剂之一，广泛应用于发酵乳制品加工中[1−2]。嗜热链球菌在牛乳发酵和贮藏过程中可赋予产品优良的质地、丰富的营养价值和独特的风味。一般认为嗜热链球菌在牛乳发酵过程中能产生乳酸和一些主要羰基化合物，如乙醛、双乙酰、乙偶姻等，可赋予产品独特的风味[3]。

气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术始于上世纪50年代。在食品香气成分分析研究中发挥着巨大的作用[4]。近年来，一些研究学者采用这项技术从发酵乳乳制品中检测出多种风味物质。王伟君等采用GC-MS等技术在嗜热链球菌发酵乳中鉴定出双乙酰、2,3-戊二酮等13种风味成分[5]。任为一等采用相同的方法从嗜热链球菌发酵乳检测出3-甲基丁醛、（E）-2-戊烯醛、辛醛、己醛、（E）-己烯醛、庚醛等16种关键性风味化合物，并发现这些化合物对产品的风味影响较大[6]。

酸奶是消费者非常喜爱的一类具有丰富营养价值和独特风味的发酵乳制品，然而，关于嗜热链球菌在牛乳发酵过程中产生的风味物质的报道较少。本实验在前期研究的基础上，以科汉森公司提供的商业发酵剂为对照组，以分离自蒙古国和中国甘肃、内蒙古、新疆、青海等少数民族地区传统发酵乳制品中的7株具有良好发酵特性的嗜热链球菌为实验菌株，采用SPME-GC-MS技术筛选出一株具有良好风味的菌株，并分析该菌株在牛乳发酵和贮藏过程中产生的挥发性风味化合物，为酸奶发酵剂的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本次实验用菌株及其来源见表1；脱脂乳粉 美国New Zealand公司；酵母粉 美国Biosharp公司；全脂乳粉 美国Fonterra LTD公司；MRS液体培养基 美国Becton公司。

表1 实验用菌株及其来源Table 1 Experimental strainsand their sources

7890B GC-5977A MSD型气相色谱-质谱联用仪，色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）美国Agilent公司；手动固相微萃取进样手柄，50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 在10%（w/w）脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1%酵母粉，在温度115℃下灭菌7 min，得到活化培养基；按照以活化培养基体积比2%的接种量，把在−80℃冷冻保藏的嗜热链球菌菌株接种于所述的活化培养基中，在37℃培养24 h，然后按照MRS液体培养基体积比2%的接种量，连续传代培养3次，使其活菌数达到108CFU/mL以上[7−8]。

1.2.2 活菌计数 利用平板菌落计数法对菌株活菌数进行测定。取1.2.1中活化三代的嗜热链球菌培养液500μL于4.5 mL无菌生理盐水（0.85%，w/w）中，充分混匀后吸取500μL液体于另一支4.5 mL无菌生理盐水，重复该操作使菌液稀释至适当浓度，从各试管中分别取100μL稀释菌液，采用MRS固体培养基倾注法，于37℃倒置培养48 h，选取菌落分布适当的平板进行活菌计数。

1.2.3 发酵乳制备

1.2.3.1 全脂乳粉培养基的制备 11.5%（w/w）全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5%蔗糖，连续均质（60℃，20 MPa）2次，95℃灭菌5 min，得到发酵培养基。

1.2.3.2 发酵条件 按照5×106CFU/mL接种量将活化后的嗜热链球菌接种于灭菌后的全脂乳粉培养基中，42℃发酵，直到发酵乳的pH降低到4.5时，停止发酵，冷却样品，−20℃保存。所有样品在相同的条件下进行3次平行实验。

1.2.4 挥发性风味物质测定

1.2.4.1 样品前处理 将5 mL发酵乳装入15 mL样品瓶中，在温度55℃下平衡10 min，然后将萃取头（50/30μm DVB/CAR/PDMS）老化后插入样品瓶中，萃取50 min，再插入气相色谱仪进样口，在270℃下解吸附3 min。

1.2.4.2 气质联用条件 起始温度35℃，保持5 min；以5℃/min升温至140℃，保持5 min；再以10℃/min继续升温至250℃，保持5 min。载气为He，流速1 mL/min；不分流进样。

1.2.4.3 质谱条件 电离方式EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，质量扫描范围35～500 m/z，发射电流100μA，无溶剂延迟。

1.2.5 挥发性风味物质的定性及定量分析 利用GC/MS工作站软件Masshunter中自带的NIST1.1标准库对各组分质谱数据结果进行自动检索，利用面积归一化法计算各组分的相对峰面积百分比，对组分进行相对定量检测。

1.2.6 发酵乳感官评定 由10名经过感官分析培训的人员组成评定小组，以中国乳制品行业规范RHB 103-2004中酸牛乳感官质量评鉴细则为评定标准，对发酵乳的色泽、滋味气味、组织状态做出评价。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel、MetaboAnalyst 3.0网站进行多维统计分析，包括成分分析（principal component analysis，PCA）图、热图等。

2 结果与分析

2.1 发酵乳中挥发性风味化合物的鉴定分析

采用SPME-GC-MS检测发酵终点（p H4.5）时对照组和7株嗜热链球菌发酵乳中的挥发性风味化合物，经NIST 11标准库检索各组分挥发性成分，利用面积归一化法计算各组分相对含量。根据检测结果可知，对照组和7株嗜热链球菌发酵乳中的挥发性风味化合物种类繁多，包括酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、含氮类、杂环类及其它化合物等。其中，一些对发酵乳风味的形成有重要作用的挥发性化合物的种类和相对含量如表2所示[9−11]。

表2 发酵终点时发酵乳中的部分重要挥发性风味化合物Table 2 Some important volatileflavor compoundsin the fermented milk at the end of fermentation

比较对照组和7株嗜热链球菌发酵乳中的一些重要的挥发性风味化合物后发现，不同菌株发酵乳中风味化合物的种类和含量有显著区别。如G80-3发酵乳中乙酸的相对含量较高，而XJ17-7发酵乳中己酸的相对含量最高，达到44.74%。乙醛是发酵乳中的重要风味化合物，除QH38-6、S13-4和G80-2外，其余4株嗜热链球菌发酵乳中均未检测出乙醛。庚醛具有强烈的油脂香味[12−14]，除G80-1、QH38-6和S13-4外，其余4株嗜热链球菌发酵乳中庚醛的相对含量接近或高于对照组。2-壬酮是由辛酸的β-氧化和癸酸的脱羧反应生成[15]。对照组和7株嗜热链球菌发酵乳中均检测出2-壬酮，且其相对含量高于其他酮类化合物。3-甲基丁醇可以使发酵乳具有麦芽香味[5]。S13-4发酵乳中具有较高含量的3-甲基丁醇，其次是G80-2发酵乳。己酸乙酯能赋予发酵乳类似苹果、香蕉气味[16]。在7株嗜热链球菌发酵乳中，仅在G80-3发酵乳检出己酸乙酯，且含量高于对照组。

2.2 感官评定结果

图1为对照组和7株实验菌株发酵乳感官评定的结果。G80-2、S13-4、MGB82-2的感官评分接近于对照组，特别是G80-2的滋味和气味得分（35.8）与对照组（35.9）最接近，因此，选择G80-2作为实验菌株进一步分析该菌株从牛乳发酵到贮藏期间产生的挥发性风味物质的动态变化规律。

图1 对照组和7株嗜热链球菌发酵乳感官评定结果Fig.1 Sensory evaluation results of control and 7 groupsof fermented milk

2.3 发酵乳中风味物质的主成分分析

发酵终点时对照组和7株嗜热链球菌发酵乳中的挥发性风味化合物PCA分析结果如图2所示。以发酵乳中挥发性风味化合物种类和含量的相似度为聚集依据，根据图中聚集度，可将对照组和7株嗜热链球菌发酵乳大致聚为3个类群，分别为G80-2S13-4JD类群、G80-3MGB82-2类群以及QH38-6G80-1XJ17-7类群。G80-2S13-4JD类群中，G80-2与对照组之间的距离最近，说明G80-2发酵乳中的挥发性风味化合物组成及含量都最接近对照组，这一结果与2.2中感官评定的结果相一致。

图2 发酵乳中挥发性风味化合物的PCA分析Fig.2 PCA analysis of volatile compounds in fermented milk

2.4 G80-2发酵乳中的挥发性风味化合物及动态分析

以G80-2为实验菌株，利用SPME-GC-MS检测牛乳从发酵到贮藏期间发酵乳中挥发性风味化合物的动态变化，一些重要的风味化合物如表3所示。

表3 嗜热链球菌G80-2发酵乳中挥发性风味物质的SPME-GC-MS鉴定结果Table 3 Volatile flavor compounds in fermented milk of S.thermophilus G80-2 by SPME-GC-MS

2.4.1 酸类化合物鉴定分析 酸类化合物通常是由乳中脂肪被脂肪酶分解得到[17]。本实验中检测到的酸类化合物主要有乙酸、己酸、庚酸及辛酸。乙酸是乳酸菌发酵产生的重要酸类物质之一，可以赋予发酵乳酸爽的风味[18]，在发酵（4、6 h）和贮藏（0、1、3、7、14 d）期间其相对含量分别为0.23%、1.02%、1.93%、2.58%、1.47%、2.04%和1.38%，整体呈先上升后下降趋势。辛酸具有微弱的水果淡酸味[19]，在发酵（2、4、6 h）和贮藏（0、1、3、7、14 d）期间其相对含量分别为0.20%、0.82%、1.34%、1.30%、1.11%、1.15%、2.25%和1.68%，于贮藏中期（7 d）相对含量到达顶峰。此外，重要的酸类化合物还有己酸，己酸具有酸味、脂肪味以及乳酪味[19−20]，在贮藏期间具有较高的相对含量，对发酵乳的滋味影响较大。

2.4.2 醇类化合物鉴定分析 醇类化合物一般由醛、酮以及氨基酸作用产生[21]。本次实验中测得的醇类化合物主要有3-甲基丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇等。在这些醇类化合物中，一些低分子醇在发酵（2、4、6 h）和贮藏（0、1、3、7、14 d）期间的相对含量较高，如1-己醇相对含量分别为5.41%、4.01%、5.00%、5.16%、4.19%、3.88%、4.77%和4.17%；而1-庚醇的相对含量分别为7.41%、4.84%、5.48%、6.12%、4.82%、4.78%、5.82%和5.27%。尽管有很多关于醇类化合物的报道，但至今为止醇类化合物对发酵乳风味的影响机理还不清楚。

2.4.3 酮类化合物鉴定分析 酮类化合物的风味阈值很低，较低的浓度能对发酵乳的风味产生重要影响。本次实验检测得到的主要酮类化合物有双乙酰、2-戊酮、乙偶姻、2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮等。大多数研究认为酮类化合物一般是由不饱和脂肪酸氧化、热降解、氨基酸降解以及微生物代谢几个途径形成[22−23]。本实验检测到双乙酰和乙偶姻的相对含量较高，在发酵（2、4、6 h）和贮藏（0、1、3、7、14 d）期间双乙酰的相对含量分别为2.12%、10.26%、9.76%、20.29%、14.49%、13.89%、14.83%和11.34%，在发酵终点（0 d）时含量到达最高值，在贮藏期间相对含量下降较为明显，这主要原因是双乙酰在贮藏过程中容易被还原为3-羟基-2-丁酮[24]。

2.4.4 醛类化合物鉴定分析 和酮类化合物类似，醛类化合物一般阈值较低，对发酵乳风味构成有重要影响[24−26]。本次实验检测得到的主要醛类化合物有乙醛、正戊醛、庚醛、苯甲醛等。乙醛是发酵乳中重要的特征风味物质，一定浓度范围内的乙醛可以赋予酸奶清爽的香味[27−28]。目前国内大部分发酵乳都是以乙醛为主要风味的醛香型发酵乳[29−30]。本实验在发酵（4、6 h）和贮藏（0、1、3、7、14 d）期间均检测到乙醛，且乙醛的相对含量较高，分别为5.45%、4.56%、3.45%、2.25%、2.78%、2.61%和1.84%。乳酸菌可通过多种代谢途径生成乙醛，本实验中乙醛的相对含量呈逐渐降低的趋势，这可能是因为受到贮存条件的影响，低温及乙醛生产相关的基因表达降低，影响发酵乳中乙醛的产量。

2.4.5 酯类化合物鉴定分析 酯类化合物是发酵乳中的重要挥发性化合物，主要通过脂肪酸水解和微生物代谢产生。一般来说，一些分子量较低的酯对发酵乳的风味影响较大，如本次实验检测到的甲酸乙烯酯，具有水果和花香味，能极大限度地降低脂肪酸和胺带来的苦味[31−32]。

2.5 不同时期发酵乳中挥发性风味化合物的热图聚类分析

利用热图对G80-2在牛乳发酵和贮藏过程中产生的挥发性风味物质进行聚类分析，结果如图3所示。根据热图的垂直方向，将所有样品分为两大类，发酵期（2、4、6 h）与贮藏期（0 d）样品聚为一类，而贮藏期（1、3、7、14 d）聚为一类。在贮藏期样品中，贮藏期（1、3、7 d）样品聚为一类，而贮藏14 d样品单独聚为一类。这可能是因为贮藏14 d样品中嗜热链球菌大量死亡，样品中风味化合物的种类和相对含量与贮藏期（1、3、7 d）有明显区别。在发酵期样品中，发酵初期（2 h）样品单独聚为一类，发酵中后期（4、6 h）及贮藏期（0 d）聚为一类，说明发酵初期（2 h）样品中挥发性风味化合物的构成明显不同于发酵中后期（4、6 h）及贮藏期（0 d）样品。这可能是因为发酵初期（2 h）发酵乳中嗜热链球菌活菌数较低，产生的风味化合物的种类和相对含量相对较少，而发酵中后期（4、6 h）及贮藏期（0 d）随着发酵乳中活菌数的增加，产生的风味化合物的种类和含量逐渐增加，较多的香气成分带给发酵乳更好的风味和感官质量。

图3 不同时期发酵乳的热图及聚类分析Fig.3 Heat map and cluster analysis of fermented milk in different periods

3 结论

以科汉森公司提供的商业发酵剂为对照组，从分离自传统发酵乳制品中的7株嗜热链球菌中筛选出一株具有良好风味的菌株G80-2，并对该菌株在牛乳发酵和贮藏期间产生的风味化合物进行检测分析。结果表明，嗜热链球菌G80-2在牛乳发酵和贮藏期间产生多种风味化合物，其中酸类化合物4种、醇类化合物10种、酮类化合物12种、醛类化合物6种、酯类化合物1种，且一些主要特征风味物质如乙酸、乙醛、双乙酰、乙偶姻、2-庚酮、1-庚醇等相对含量较高，对发酵乳风味的形成发挥了重要的作用。热图聚类分析的结果表明，发酵和贮藏期间发酵乳中挥发性风味物质差异较大，说明随着发酵时间的延长，发酵乳中的挥发性风味物质差异显著。