电子束辐照杀菌对食用葛根粉品质的影响

徐远芳，张祺玲，周毅吉，毛青秀，李文革，陈石新，邓钢桥，彭 玲,

（1.湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所，湖南长沙 410125；2.湖南省农业生物辐照工程技术研究中心，湖南长沙 410125；3.生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南长沙 410125；4.中南粮油食品科学研究院有限公司，湖南长沙 410100；5.常德市犟哥生态农业科技有限公司，湖南常德 415300）

食用葛根粉是从豆科葛属（PuerariaDC.）植物粉葛（P.thomsoniiBenth）的块根中提取的，经过粉碎、分离、过滤、干燥而成的粉状产品[1]。葛根是我国卫生部首批批准的药食两用植物，享有“南参北葛”、“亚洲人参”等美誉[2]。葛根粉中淀粉含量很高，是其主要食用成分，此外还含有丰富的异黄酮、膳食纤维、氨基酸、矿质元素等成分[3]，主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分，对心血管疾病[4−5]、糖尿病[6]、癌症[7]等疾病有治疗作用[8]。葛根粉具有洁白细腻、清香可口、淀粉糊透明度高、粘度稳定性好等特点，既可直接冲泡食用，也可加工成保健食品，市场前景广阔[9]。葛根粉在加工储存过程中，微生物含量容易超标，有必要对其进行合理的灭菌，以确保产品的卫生质量。

葛根粉中异黄酮类等活性成分具有热不稳定性[10]，不适合采用传统的高温方法进行灭菌。辐照是一种冷加工方法，采用适宜剂量辐照能有效控制食品中污染的微生物，并且不会引起产品营养及功能活性成分的明显破坏，是解决食用葛根粉微生物超标问题的有效方法。目前，大部分市售保健食品都是通过辐照进行灭菌的[11]。电子束辐照是辐照技术应用的重要形式，与60Co-γ射线辐照相比，电子束辐照具有操作简单、使用安全，能量利用率高，辐照效率高，成本低等优势[12]。近年来，随着电子加速器设备的不断改进和完善，电子束流的稳定性大大提高，电子束辐照技术在社会经济效益和加工能力方面的优势逐步显现，有取代60Co-γ射线辐照成为辐照产业主流的趋势[13]。关于电子束辐照技术在葛根粉辐照灭菌中的应用研究，目前国内外暂无相应的报道。

本文以食用葛根粉为对象，采用不同剂量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）电子束进行辐照处理，以食用葛根粉中微生物存活数（菌落总数、霉菌数、大肠菌群数）、一般营养成分（水分、蛋白质、脂肪、灰分、淀粉、膳食纤维、多糖、维生素B1、维生素B2）、异黄酮类成分（葛根素、大豆苷、大豆苷元）、物理性能（白度、冻融稳定性、溶解度、膨润力）以及抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羟自由基（·OH）清除能力、还原力）为评价指标，研究电子束辐照对食用葛根粉微生物的杀菌效果及品质的影响，旨在为电子束辐照技术在葛根粉及其相关产品中微生物的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用葛根粉 常德市犟哥生态农业科技有限公司提供，粉状，颜色暗白、略带微黄；平板计数琼脂培养基、孟加拉红琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤 广东环凯微生物科技有限公司；葛根素对照品（含量以99.71%计）、大豆苷对照品（含量以99.46%计）、大豆苷元对照品（含量以99.99%计） 成都曼思特生物科技有限公司；D-无水葡萄糖对照品（含量以99.8%计） 中国食品药品检定研究院；氯化钠、石油醚、硫酸钾、浓硫酸、盐酸等分析纯、正己烷（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司。

IS1020电子束辐照加工系统（10 MeV/20 kW）同方威视技术股份有限公司；MS304s/01电子分析天平 瑞士梅特勒公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；BCM-1000超净工作台 苏州净化设备有限公司；SPX-250B生化培养箱 天津泰斯特仪器有限公司；MJ霉菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；KDN-12D 12孔数显消化炉 上海洪纪仪器设备有限公司；KQ-300VDB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；KT 200 FOSS凯氏定氮仪蒸馏器 美国培安公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；SHA-CD水浴恒温振荡器常州澳华仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；Allgera 64低温离心机 美国贝克曼公司；WSB-L白度计 上海仪电物理光学仪器有限公司；DW-40L508立式低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计 日本岛津公司；e2695液相色谱仪 美国沃特世公司；LC 20AT液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试验样品准备 将食用葛根粉用透明PE自封袋进行分装，每袋50 g，共18份，用于微生物检测；每袋250 g，共18份，用于理化指标检测。样品分装完成后即送至辐照。

1.2.2 电子束辐照 电子束辐照在湖南湘华华大生物科技有限公司进行，电子加速器输出功率为10 kW，电子束流扫描速率为220次/s，电子束能量为10 MeV。为保证样品受到均匀照射，将样品平铺放置于电子束辐照专用金属托盘上，厚度约3～4 cm，不同电子束辐照剂量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）通过控制托盘在电子束下的传输速度来实现，辐照完成后室温储存待测。

1.2.3 微生物存活数的测定 按GB 4789.2-2016方法测定食用葛根粉菌落总数；按GB 4789.15-2016方法测定霉菌数；按GB 4789.3-2016方法测定大肠菌群数。

1.2.4 一般营养成分含量的测定 食用葛根粉水分含量：按GB 5009.3-2016方法测定；蛋白质含量：按GB 5009.5-2016方法测定；脂肪含量：按GB 5009.6-2016方法测定；灰分含量：按GB 5009.4-2016方法测定；膳食纤维含量：按GB 5009.88-2014方法测定；淀粉含量：按GB 5009.9-2016方法测定；维生素B1含量：按GB 5009.84-2016方法测定；维生素B2含量：按GB 5009.85-2016方法测定。

1.2.5 多糖含量的测定 根据李定芬等[14]的方法进行测定。精密称取经105℃葡萄糖对照品0.0060 g置50 mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.12 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL对照品溶液置于1 mL比色管，体积不足1.0 mL者，加纯水补足至1.0 mL。

精密称取食用葛根粉0.0800 g，置于150 mL圆底烧瓶中，精密加纯水100 mL，称重，加热回流提取1 h后取出，放冷，再次称重，用纯水补足减失重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密吸取续滤液0.5 mL，备用。

取对照品溶液和供试品溶液0.5 m1置于25 mL比色管中，加水补足至1 mL，分别加入5%的苯酚溶液2 mL，摇匀，再分别加入浓硫酸7 mL，摇匀后置沸水浴中加热15 min后取出，于冷水中降至室温，于波长490 nm处测定吸光度。

1.2.6 异黄酮类成分含量的测定 根据常飞等[15]的方法进行测定。精密称取食用葛根粉1.000 g，加入到50 mL容量瓶中，用30%乙醇（V/V）定容，置于40℃恒温水浴中超声提取60 min，冷却至室温，用30%乙醇再次定容，摇匀，用0.25μm滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。分别制备葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品的标准曲线，测定样品中对应异黄酮类成分的吸收峰面积，以对照品的标准曲线为对照计算样品中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量。

色谱条件：色谱柱Athena-C18（4.6 mm×250 mm,5μm），以甲醇和水为流动相，按照表1的洗脱条件进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量5μL，检测波长250 nm。

表1 HPLC梯度洗脱条件Table 1 Elution conditions of HPLC

1.2.7 物理性能的测定

1.2.7.1 白度的测定 按GB/T 22427.6-2008方法测定。

1.2.7.2 溶解度和膨润力的测定 根据侯蕾等[16]的方法进行测定。精密称取食用葛根粉1 g（精确至0.001 g），用纯水配制成50 mL质量分数为2%的葛根粉溶液，置于85℃恒温水浴并搅拌30 min，水浴后倒入离心管进行离心(3000 r/min,15 min)，取上清液置于105℃烘箱进行烘干称重，此部分即为水溶性葛根粉的质量，离心管中沉淀部分为膨胀葛根粉，分别按公式（1）和（2）计算葛根粉的溶解度和膨润力。

1.2.7.3 冻融稳定性的测定 根据侯蕾等[16]方法进行测定。配制质量分数3%的食用葛根粉溶液50 mL，沸水浴15 min（加热过程中需保持溶液体积不变），在室温下冷却，准确移取一定质量葛根粉糊至50 mL塑料离心管，置于−20℃低温保存箱冷冻24 h，取出后在室温下解冻，于4000 r/min离心20 min（如无水析出，反复冻融至有水析出），用滤纸过滤，称取滤纸上沉淀物的质量，按公式（3）计算析水率。

1.2.8 食用葛根粉抗氧化活性的测定 根据吴琼等[17]的方法进行样品制备和抗氧化能力的测定。称取食用葛根粉2.0 g，加入80 mL体积分数70%乙醇溶液，置于80℃恒温水浴锅中避光浸提30 min，提取液在3000 r/min离心10 min，取上清液作为抗氧化成分提取液，置于冰箱冷藏备用。

1.2.8.1 DPPH自由基清除率测定 用乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，避光保存备用。取3.0 mL上述提取液与3.0 mL DPPH溶液混合均匀，避光放置30 min，于波长517 nm处测定吸光度AX。同时，取3.0 mL乙醇与3.0 mL DPPH溶液混匀，避光放置30 min，于波长517 nm处测定吸光度A0，同时以乙醇作为空白。按照公式（4）计算DPPH自由基清除率：

1.2.8.2 ·OH清除率测定 在试管中加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各2.0 mL，再加入2.0 mL提取液和2.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混匀，避光置于37℃水浴10 min，于波长510 nm处测定吸光度AX。试管中以纯水水代替H2O2测定吸光度AX0，以纯水替代提取液测定吸光度A0，同时以蒸馏水做空白调零。按公式（5）计算·OH清除率。

1.2.8.3 还原力测定 配制0.2 mol/L pH6.6的磷酸缓冲液（phosphate buffer saline,PBS），在试管中加入PBS、提取液、质量分数1%铁氰化钾溶液各2 mL，混匀于50℃水浴20 min，冷却至室温，加入2 mL质量分数10%三氯乙酸溶液，混匀，使反应终止。取反应液5 mL于试管中，加入纯水4 mL，质量分数0.1% FeCl3溶液0.5 mL，混匀并置于暗室反应30 min，于波长700 nm处测定吸光度。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0软件进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）中的Duncan检验在P<0.05显著水平上进行均值差异性相关性分析，结果以3次重复实验所得数据的±s表示。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对食用葛根粉微生物存活数的影响

食用葛根粉中初始菌落总数为2.2×103CFU/g，霉菌数为5.0×10 CFU/g，大肠菌群数为15.0 MPN/g。不同剂量电子束辐照后食用葛根粉中微生物存活数见表2，经2.5 kGy电子束辐照后，样品菌落总数降至4.0×102CFU/g，霉菌数小于10 CFU/g，大肠菌群数为0.36 MPN/g。7.5 kGy辐照即可有效控制其微生物存活数。因此，电子束辐照对食用葛根粉杀菌效果显著，随着辐照剂量增加，污染微生物存活数逐渐降低。根据食用葛根粉菌落总数的对数值（lgN）与辐照剂量的拟合方程（y=−0.3731x+3.4065，R2=0.9860），求出电子束辐照对食用葛根粉菌落总数杀菌剂量的D10值为2.68 kGy。这与电子束辐照其他同类产品的研究结果相似，赵巧丽等[18]、陈志军等[19]分别研究得出电子束辐照对松花粉、灵芝孢子粉菌落总数的杀菌剂量D10值分别为1.94和2.17 kGy。D10值是一个重要的辐照技术参数，它是指杀灭90%的微生物所需的辐照剂量[20]，即表明2.68 k Gy剂量电子束辐照可使食用葛根粉中菌落总数的存活数降低1个数量级。

表2 电子束辐照食用葛根粉微生物存活数的影响Table 2 Effectsof electron beam irradiation on mcrobial survival of ediblekudzu root powder

2.2 电子束辐照对食用葛根粉一般营养成分的影响

电子束辐照对一些食品营养成分有一定的影响，不同种类营养成分的辐射敏感性有差异，主要取决于辐照食品的种类、辐照环境和辐照剂量。由表3可知，不同剂量电子束辐照对食用葛根粉水分、灰分、蛋白质以及淀粉的含量无明显影响（P>0.05），这与魏会惠等[21]对电子束辐照小麦粉的研究结论一致。食用葛根粉脂肪含量为0.10 g/100g，属于低脂食品，辐照后样品脂肪含量显著高于对照组样品（P<0.05），与辐照剂量无明显的相关性。究其原因，可能是由于电子束辐照在加速葛根粉中的蛋白质氢键的断裂，使其分解出部分氨基酸的同时，又加速了氨基酸的脱氨、脱羧作用，生成各种脂肪酸，从而使辐照后样品脂肪含量增加。辐照样品多糖含量显著高于对照组样品（P<0.05），2.5～10.0 kGy范围内随着辐照剂量增大，样品多糖含量逐渐增加，这与朱佳廷等[22]关于辐照螺旋藻粉多糖含量变化的研究结论相似，究其原因，是由于电子束辐照使样品中纤维素等大分子发生了降解。辐照后样品膳食纤维的含量减少，2.5～10.0 k Gy时辐照样品显著低于对照组样品（P<0.05）。李杨等[23]研究辐照对豆渣可溶性膳食纤维结构与理化性质的影响，结果发现辐照剂量增加会使膳食纤维发生降解，纤维结构变得疏松膨胀。Fernandes等[24]报道了电子束辐照后两种干蘑菇中不溶性纤维和总纤维量显著降低，这与本研究结论相似。维生素B1和B2都是能量代谢中不可缺少的成分。辐照对样品维生素B1与维生素B2的含量影响不大，与辐照剂量无线性相关性。因而，采用不超过12.5 kGy电子束辐照对食用葛根粉的一般营养成分含量无明显的破坏作用，不会影响其营养品质。

表3 电子束辐照对食用葛根粉一般营养成分的影响Table 3 Effects of electron beam irradiation on normal nutrient of edible kudzu root powder

2.3 电子束辐照对食用葛根粉异黄酮类成分的影响

葛根是我国传统中药，其主要有效成分是葛根素、大豆苷和大豆苷元等异黄酮类成分，以葛根素为主，也是本属特有的活性成分，其含量约占葛根总黄酮的一半以上，因此，通常把葛根素的含量高低作为葛根质量评价的主要指标[25]。由表4可知，电子束辐照对食用葛根粉中葛根素含量的影响不大，除7.5 k Gy辐照样品外，其余辐照样品葛根素的含量与对照组样品相比略有增加，10.0 k Gy时差异显著（P<0.05），大豆苷和大豆苷元的含量变化均无显著差异（P>0.05），结果表明电子束辐照对食用葛根粉中主要异黄酮类成分的影响不大。前期国内学者研究了不同剂量的60Co-γ射线辐照保济丸[26]、通脉颗粒[27]及柴葛退热散[28]等中成药，结果表明60Co-γ射线辐照对其主要有效成分葛根素的含量均无明显影响，这与本文的研究结论一致，但关于电子束辐照对葛根素成分影响的研究尚鲜见。徐远芳等[29]报道了不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照前后葛根提取物的指纹图谱相似度均为1.0，2种辐照方式均不会影响其主要功能活性成分的质量稳定性及有效性，这与本文的研究结论相似。因此，12.5 k Gy以内剂量电子束辐照对食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量无明显影响。

表4 电子束辐照对食用葛根粉异黄酮类成分的影响Table 4 Effects of electron beam irradiation on isoflavone active substances of edible kudzu root powder

2.4 电子束辐照对食用葛根粉物理特性的影响

食用葛根粉的主要成分是淀粉，葛根淀粉具有糊化温度低、透明度高、粘度稳定性强等特点，是一种优质的食品加工原料淀粉来源。由表5可知，电子束辐照对食用葛根粉白度、冻融稳定性（以析水率计）、溶解度以及膨润力有一定的影响。经不同剂量电子束辐照后，样品的白度均显著低于对照组样品（P<0.05），但其白度值变化不大。冻融稳定性是指淀粉糊经冷冻处理，取出融化后保持原来胶体结构的特性，是判定淀粉是否有利于制作冷冻食品的重要指标之一。以析水率表征淀粉的冻融稳定性，析水率越高，冻融稳定性越差，反之越好[16]。与对照组样品相比，辐照样品的析水率显著降低（P<0.05），2.5～10.0 k Gy剂量范围内，随着辐照剂量的增加样品析水率逐渐下降，表明电子束辐照能显著增强葛根粉的冻溶稳定性，从而增加其作为冷冻食品加工原料的适应性。辐照后样品的溶解度和膨润力均明显增大（P<0.05），其变化与辐照剂量呈正相关，说明电子束辐照辐照使产品的溶解性增加，有利于提高产品的冲调性。目前，关于电子束辐照对淀粉功能特性的影响已有研究报道[30−31]，与本文的研究结论基本一致，可通过电子束辐照方法对淀粉进行改性。因此，采用12.5 k Gy以内电子束辐照有望改善葛根淀粉的物理性能，提高食用葛根粉的食用品质。

表5 电子束辐照对食用葛根粉物理性能的影响Table 5 Effects of electron beam irradiation on physical propertiesof edible kudzu root powder

2.5 电子束辐照对食用葛根粉抗氧化活性的影响

葛根粉中含有多种活性成分，其主要活性成分是异黄酮类和多糖，均具有较强的抗氧化活性，对DPPH自由基、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O−2）等活性自由基具有较强的清除作用[32−33]。由表6可以看出，电子束辐照对食用葛根粉DPPH自由基清除率、羟自由基（·OH）清除率和还原力的影响不一。与对照组样品相比，2.5～10.0 k Gy辐照样品对DPPH自由基的清除率显著低于对照组样品（P<0.05），12.5 k Gy时显著高于对照组样品（P<0.05），但其变化与辐照剂量无明显的线性相关关系。不同剂量辐照样品的还原力均有所下降，5 kGy及以上剂量辐照样品还原力显著低于对照组样品（P<0.05）。辐照后样品对羟自由基（·OH）的清除率与对照组样品相比无显著差异（P>0.05）。本文作者前期研究了60Coγ射线和电子束辐照对葛根提取物抗氧化活性的影响，结果发现2种辐照方式对葛根提取物的DPPH自由基、羟自由基（·OH）的清除率以及还原力的无明显影响[29]，这与本研究的结论不完全一致。分析其原因，电子束辐照对食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元等3种主要异黄酮类成分的含量无明显影响，而辐照后样品多糖成分的含量及分子构象会发生变化[34−35]，可能会对其抗氧化活性产生影响，尚有待进一步研究。因此，不超过12.5 kGy的电子束辐照对食用葛根粉中活性成分的抗氧化能力不会产生明显的破坏作用。

表6 电子束辐照对食用葛根粉抗氧化活性的影响Table 6 Effects of electron beam irradiation on antioxidant activity of edible kudzu root powder

3 结论

电子束辐照对食用葛根粉中污染微生物具有明显的杀菌作用，且辐照剂量越大，微生物存活数越少。电子束辐照对食用葛根粉菌落总数杀菌剂量的D10值为2.68 k Gy，对初始菌落总数为2.2×103CFU/g的食用葛根粉，7.5 kGy剂量电子束辐照即可控制其中的微生物含量。电子束辐照对食用葛根粉中一般营养成分含量（水分、灰分、蛋白质、淀粉、维生素B1和B2）、异黄酮类活性成分含量（葛根素、大豆苷、大豆苷元）以及羟自由基（·OH）清除率无明显影响。辐照后葛根粉脂肪含量明显增加，膳食纤维含量、白度、DPPH自由基清除率以及还原力有所降低，但总体变化幅度不大。多糖含量、溶解度、膨润力均显著增大，冻融稳定性明显增强。因此，电子束辐照是一种有效的食用葛根粉灭菌方式，12.5 kGy以内电子束辐照不会对食用葛根粉的营养及功能活性成分产生明显的破坏作用，并且有望改善其作为食品加工原料的物理性能。