GeneXpert MTB/RIF试验对结核性腹膜炎的诊断价值

王琦，周建平

（1.中国医科大学附属第一医院胃肠外科/疝外科，沈阳 110001；2.沈阳市第十人民医院普通外科，沈阳 110041）

结核病是由结核杆菌引起的疾病，按单一致病菌致死率排序，结核病高居榜首。在22个结核病高发的国家中，中国位居前三名［1］。临床将除肺结核外的所有结核病统称为肺外结核，结核性腹膜炎（tuberculous peritonitis，TBP）为较常见的肺外结核，其发病率一直居高不下，主要是由于感染结核分枝杆菌，临床上以腹腔感染为主要表现，该病亦是腹腔积液的常见原因之一［2］。统计发现，女性TBP患病率高于男性［3］。临床上TBP的诊断存在普遍滞后的现象，这主要是因为TBP起病初期的症状不典型，特异性很低，很容易造成误诊，所以需尽早诊断并进行治疗干预，以改善患者预后。治疗延误或失治可引发肠粘连、不完全性肠梗阻等不良结局［4］。单纯依据临床表现很难明确TBP诊断，依据实验室检测结果进行诊断对早期患者尤为重要。临床上诊断TBP的方法不尽相同，实验室培养结核分枝杆菌、组织病理检查、抗酸染色以及干扰素释放试验、分子学诊断即聚合酶酶链反应等较为多用［5］。本研究探讨了一项结核分枝杆菌检测新技术——利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin assay，简称GeneXpert MTB/RIF试验）［6］在诊断TBP上的优势。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2018年5月至2020年3月在沈阳市第十人民医院就诊的疑似TBP患者90例，年龄28～63岁。所有患者均行开放或腹腔镜手术活体组织检查，其中确诊为TBP的患者33例（TBP组），包括男16例，女17例，平均年龄（40.85±5.70）岁；非TBP的患者57例（非TBP组），包括男27例，女30例，平均年龄（40.51±7.89）岁。所有患者手术取组织标本（应用腹腔镜摘取患者病变组织3～4处或开腹取病变组织作为活体组织标本），将标本放入无菌容器内，并及时送检。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色：将收集的活体组织按照实验规范《结核病细菌学检验规程》进行处理。将获取的组织置于10%中性福尔马林固定液中固定，常规脱水处理，石蜡包埋后切片，应用专用制剂进行HE染色。光镜下观察后行抗酸染色，常规脱蜡至水后进行石碳酸复红染液染色（15～30 min），之后用盐酸乙醇对标本进行脱色分化，水洗后再用美兰复染剂轻染，显微镜下观察并记录结核分枝杆菌数目。

1.2.2 GeneXpert MTB/RIF试验：将收集的组织标本充分研磨后取1～2 mL，将标本和2～3倍体积的处理液放置于螺旋管中，消化处理15 min，然后将消化处理后的标本取2 mL放入GeneXpert MTB/RIF试剂盒中，随后将试剂盒放入GeneXpert MTB/RIF检测系统中，输入相关信息后进行检测。GeneXpert会自动对样品组织进行滤过与洗涤，超声溶菌解离DNA后与PCR试剂混合，通过实时扩张进行荧光检测。该试验主要是通过测得不同标本的循环阈值（cycle threshold，Ct）来判定结果，Ct值的含义为每个处置管内收集的荧光信号抵达设定阈值时呈现的循环数。通过该试验结果可以准确得出结核分枝杆菌的数量和利福平的耐药程度。

1.2.3 BACTEC MGIT 960液体培养和药敏试验：根据BACTEC MGIT 960操作手册，将采集完好的组织液1 mL加入至MGIT液体培养容器内进行结核分枝杆菌培养，取第3～5天阳性结果的培养容器，然后用滴管准确取1 mL作为待检液体，随后将其放入无菌生理盐水中进行稀释（比例为1 ∶4），以此作为稀释菌液。随后将稀释菌液按1 ∶100的比例进一步稀释，得到对照菌液。各取500 μL稀释菌液和对照菌液进行利福平耐药试验和药敏试验，取出液体在试管中混合均匀，然后放入BACTEC MGIT 960检测仪器的培养箱中，检测周期为13 d，得到药敏和利福平耐药结果。判定结核分枝杆菌存在的条件：（1）抗酸涂片染色（+）；（2）革兰氏染色无杂菌生长；（3）结核胶体金检测（+），上述3点必须全部符合。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计分析。计数资料用率表示，采用χ2检验进行比较，计量资料用表示，采用方差分析进行比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种诊断方法的效果比较

GeneXpert MTB/RIF试验对结核分枝杆菌的检测灵敏度为81.82%，特异度为100%；BACTEC MGIT 960液体培养法对结核分枝杆菌的检测灵敏度为30.3%，特异度为100.00%；抗酸染色法对结核分枝杆菌的检测灵敏度为21.21%，特异度为94.74%。GeneXpert MTB/RIF试验对结核分枝杆菌检测的灵敏度明显高于BACTEC MGIT 960液体培养法（χ2=17.78，P＜ 0.01）和抗酸染色法（χ2=24.26，P＜0.01）。见表1。

表1 3种方法对TBP诊断效果的比较

2.2 利福平耐药性的比较

10份BACTEC MGIT 960液体培养阳性的药敏试验显示，利福平结核分枝杆菌耐药占40%，利福平结核分枝杆菌敏感占60%。以BACTEC MGIT 960液体培养的药敏结果作为金标准，GeneXpert MTB/RIF试验检测利福平结核分枝杆菌耐药的灵敏度可达75.00%（3/4），特异度为83.33%（5/6）。

3 讨论

TBP不同于其他结核病，具有发病率、致残率、致死率高的特点。同时，TBP属于肺外结核，其诊断与肺结核等结核病的诊断方法截然不同。结核分枝杆菌在痰中的含量很少，故常规临床中将分离痰内结核分枝杆菌的检测方法用于诊断TBP效果并不理想，TBP的诊断难度较肺结核更高。既往细菌学检测一直是TBP诊断的核心方法，但阳性检出率较低，已经逐渐被临床淘汰。由于TBP的临床表现不典型，加上临床诊断上存在一定程度的误诊、漏诊，故国内外专家一直在致力于寻找特异度高、灵敏度好、操作简便的TBP诊断方法。

本研究选取33例TBP患者和57例非TBP患者，应用不同的检测方法进行诊断。结果显示，GeneXpert MTB/RIF试验对TBP诊断的灵敏度为81.82%，高于BACTEC MGIT 960液体培养法（30.30%）和抗酸染色法（21.21%）。研究结果表明，GeneXpert MTB/RIF试验对TBP的诊断精准度更高、灵敏度更好。同时，GeneXpert MTB/RIF检测利福平结核分枝杆菌耐药TBP的灵敏度可达75.00%，特异度为83.33%，而BACTEC MGIT 960液体培养阳性的药敏试验结果虽为检测结核分枝杆菌的金标准，但其灵敏度和特异度均低于GeneXpert MTB/RIF试验。

抗酸染色法对标本内细菌含量的要求较高。抗酸染色结果阳性要求标本中浆膜腔内细菌群至少在5 000 U/mL以上，若积液中细菌群仅为1 000 U/mL，那么检出率为50%左右，只有细菌群超过10 000 U/mL时，检出率才能超过90%。同时，由于检测过程中标本极易在染色冲洗过程中被干扰，再加上试验条件、人为等主客观因素，该方法的阳性检出率低。BACTEC MGIT 960液体培养作为检测结核分枝杆菌的金标准，虽在临床应用中灵敏度有所提高，但结核分枝杆菌特殊的结构特点与生理特性决定了其培养时间相对较长。再加上结核分枝杆菌对培养基营养需求极其苛刻，只能在富含充足的血清、甘油、马铃薯或一些无机盐的特殊培养材质下才能正常生长与繁殖，若无合适的氧分供应和温度调节则难以成功培养，多数临床条件难以支持，很难满足快速诊断、早期诊断的需要。T-spot检测是近年来活跃在临床一线的结核特异性抗体检测方法，T-spot检测虽然具有较高的灵敏度，但假阳性率较高，因此本研究并未应用，再加上其检测费用较高，并不适合广泛推广。

随着科学技术的发展，实时荧光定量条件下的核酸扩增技术用于医学试验和临床日趋广泛，该技术成功应用的典范——GeneXpert MTB/RIF试验，对结核类疾病的检测表现出较高的灵敏度和特异度［7-9］。GeneXpert MTB/RIF试验是一种全自动操作，仪器应用半巢式实时荧光条件下定量PCR技术，设定rpoB基因为引物探针，在含菌量为10～100 U/mL时即可精确识别分拣。前期将标本稀释制备后，放入检测仪器中，仪器自动对标本实施采集、提取核酸并进行扩增，对结核分枝杆菌及利福平耐药的核心检测周期仅为2 h，大大提高了检测效率［10］。而且研究显示GeneXpert MTB/RIF试验的检测结果准确度较高，目前大多数临床和实验中心已逐渐将该技术大范围用于结核病的检测和筛查。GeneXpert MTB/RIF检测系统采用rpoB基因为引物探针，该基因与利福平耐药相关［11］，应用该仪器可同时检测结核分枝杆菌数目和利福平耐药情况。李晓非等［12］利用GeneXpert MTB/RIF试验对1 386例疑似结核病患者进行诊断，结果显示GeneXpert MTB/RIF试验对结核病的诊断和治疗有效，尤其擅于早期发现和治疗多药耐药结核病。PATIL等［13］对诊断率较低、极易误诊的下肺野结核进行研究，收集了2 600例结核患者，应用支气管灌洗液样本进行GeneXpert MTB/RIF检测，认为GeneXpert MTB/RIF试验是评估下肺野结核的最佳诊断方法，可以广泛应用于临床。METAFER IA等［14］对埃塞俄比亚的肺外结核病例进行了横断面研究，收集了353例肺外结核病例，发现GeneXpert MTB/RIF试验的应用比例高达71%，其中包括很多涂片阴性的患者，能够显著降低诊断的假阴性率。说明GeneXpert MTB/RIF试验能够解决肺外结核的检测难题，在保证检测准确性的同时，减少了复杂的人工程序，缩短了检测周期，因此具有较高的临床实用性。另外，本研究在确诊为TBP的33例患者术中同时取腹水样本21例，进行了GeneXpert MTB/RIF试验检测，结果均为阴性，提示临床应用GeneXpert MTB/RIF试验检测TBP时需要对患者进行活体组织检查，才能保证检出率。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF试验在TBP结核分枝杆菌检测方面有明显优势，主要表现在其灵敏度水平与特异性表现，同时具有方便、快捷、高效等优点，故在临床与诊断实践中对TBP的快速诊断以及利福平耐药情况的判定方面具有一定的临床应用价值。