超高效液相色谱法同时测定血美安胶囊中4种成分的含量

田明（湖北省荣军医院药剂科，武汉 430079）

血美安胶囊收载于2020年版《中国药典》一部成方制剂和单味制剂部分，是由猪蹄甲、赤芍、牡丹皮、地黄4 味中药加工制成的复方制剂，具有清热养阴、凉血活血作用，用于原发性血小板减少性紫癜血热伤阴挟瘀症，症见皮肤紫癜、齿衄、鼻衄、月经过多、口渴、烦热、盗汗等[1]。现代药理研究表明血美安联用其他药物治疗特发性血小板减少性紫癜有较好疗效[2-3]，还可用于治疗乙型肝炎病毒相关血小板减少症[4]。血美安胶囊的质量标准中有芍药苷和丹皮酚的含量测定项目，但该标准是2002年申报新药时制订的，且芍药苷和丹皮酚不是同时检测，耗费时间。因此，有必要对血美安胶囊的质量标准进行提升研究。研究表明，猪蹄甲主要含蛋白质、氨基酸等成分，赤芍含芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等活性成分，牡丹皮含丹皮酚、芍药苷、没食子酸等活性成分，地黄含梓醇、二氢梓醇、毛蕊花糖苷等活性成分[5-8]。赤芍、牡丹皮、地黄药材的质量控制方法报道较多，但未见同时测定血美安胶囊中没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚4 种成分的报道[9-11]。没食子酸具有抗氧化、保护心脑血管、抗炎、保肝等药理活性，氧化芍药苷、芍药苷具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、保肝、保护神经、调节免疫、镇静催眠等多种药理活性，丹皮酚具有抗动脉粥样硬化、舒血管与降压、抗心律失常、抗脑缺血等作用[12-15]。上述4 种成分为赤药和牡丹皮的主要活性成分，赤芍具有清热凉血、散瘀止血的功效，牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀的功效，共同发挥清热、活血凉血的作用。本研究建立UPLC 法同时测定血美安胶囊中没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的含量，为其质量控制提供简便、快速可靠的检测方法。

1 仪器与试药

超高效液相色谱仪（型号：ACQUITY UPLC H-CLASS，美国Waters 公司）；XSE205DU 十万分之一电子天平、ME204T/02 万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波清洗器（型号：DTC-27，功率：700W，频率：40 kHz，湖北鼎泰高科有限公司）。

对照品没食子酸（批号：110831-201906，纯度：91.5%）、芍药苷（批号：110736-202044，纯度：96.8%）、丹皮酚（批号：110708-201908，纯度：99.8%）（中国食品药品检定研究院），氧化芍药苷[批号：ST132301，纯度：98.0%，萨恩化学技术（上海）有限公司]。血美安胶囊样品（规格：0.27 g/粒，批号：190601、190602、190603、190604，湖北民康制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液

精密称取各对照品适量，加入80%乙醇溶解，配制成含没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚分别为0.84、0.75、1.41、1.18 mg·mL－1的单一对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用80%乙醇稀释成含没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚分别为42.05、37.60、70.70、59.05 µg·mL－1的混合对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液

取血美安胶囊适量，称取约0.5 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，再加35 mL 80%的乙醇溶液，超声（700 W，40 kHz）提取30 min，放冷至室温，用80%乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液

按血美安胶囊的处方工艺制备缺赤芍、牡丹皮的阴性样品，再按“2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.4 色谱条件及系统适用性考察

采用Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）色谱柱，柱温30℃；以0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，线性梯度洗脱（0～5 min，6%B；5～6 min，6%→15%B；6～8 min，15%B；8～13 min，15%→18%B；13～15 min，18%～25%B；15～17 min，25%～26%B；17～19 min，26%～27%B；19～24 min，27%～31%B；24～27 min，31%～33%B；27～35 min，33%～37%B；35～38 min，37%～6%B；38～40 min，6%B）；体积流量为0.20 mL·min－1，检测波长为230 nm，进样量为2 µL。各待测成分的峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000。色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液（A）、供试品溶液（B）与缺芍药、牡丹皮的阴性样品溶液（C）的UPLC 图Fig 1 UPLC chromatogram of mixed control（A），sample（B）and negative sample（C）

2.5 线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下单一对照品储备液适量，用80%乙醇稀释成含没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚分别为168.20、150.40、282.80、236.20 µg·mL－1的混合对照品溶液，再吸取混合对照品溶液0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别置于10 mL 的量瓶中，加80%乙醇溶液定容，摇匀，配制成系列质量浓度混合对照品溶液；按“2.4”项下色谱条件分别进样2 µL，测定各成分的峰面积。以各成分的质量浓度X（µg·mL－1）为横坐标，平均峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；以信噪比（S/N）3∶1 和10∶1 为基准测定，分别计算上述各成分的检测限和定量限，结果见表1。

表1 4 种成分的线性关系(n＝6)Tab 1 Linearity correlation of 4 components

2.6 精密度试验

精密吸取线性关系第3 点的混合对照品溶液2 µL，重复进样6 次，记录各成分的峰面积并计算RSD值。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚峰面积的RSD（n＝6）分别为0.64%、0.59%、0.98%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

分别精密称取血美安胶囊（批号：190601）样品6 份，按“2.2”项下方法配制6 份试品溶液，各进样2 µL，记录没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积，代入“2.5”项下线性回归方程，计算各成分的含量。结果样品中没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的平均含量分别为3.23、1.48、4.81、4.07 mg·g－1，RSD依次为0.39%、0.81%、0.21%、0.67%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一份供试品溶液（批号：190601），分别在放置0、3、6、12、18、24 h 后，精密吸取2µL，进样分析，记录没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚色谱峰的峰面积值，计算得各成分的RSD分别为0.48%、1.1%、0.37%、0.67%，表明供试品溶液中各成分在放置24 h 内稳定性较好。

2.9 加样回收试验

取已知含量的血美安胶囊9 份，每份约0.25 g，精密称定，每3 份作为一组，分别置50 mL量瓶中，精密加入一定量的没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的对照品储备液，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.4”项下色谱条精密吸取2 µL，进样分析，记录各成分的峰面积，计算平均回收率，没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚平均回收率在96.1%～101.5%，RSD均小于1.5%，表明该方法的准确度良好。

2.10 样品测定

取不同批次血美安胶囊样品各3 份，分别制备成供试品溶液，精密吸取2 µL，进样分析，记录峰面积，并采用“2.5”项下回归方程计算没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的含量，结果见表2。

表2 4 种成分的含量测定结果(mg·g－1，n＝3)Tab 2 Content determination of 4 components (mg·g－1，n＝3)

3 讨论

本试验利用PDA 检测器分别提取了没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的紫外全波长扫描图谱，发现氧化芍药苷、芍药苷在230 nm波长处有强吸收，没食子酸、丹皮酚在230 nm、273 nm 处附近有强吸收，273 nm 波长下，氧化芍药苷、芍药苷吸收较弱，230 nm 波长检测时，基线稳定，各成分峰形较好，杂质干扰小，因此选择230 nm 作为检测波长。

本试验在流动相系统考察时，发现等度洗脱时所测的4 个成分与旁边峰难以达基线分离；用甲醇作为有机相时，各成分峰较宽，拖尾严重；用乙腈作为有机相时，被测4 个成分的分离度符合要求，峰形窄且对称性好。试验进行耐用性考察时，分别考察了不同流速（0.18、0.2、0.22 mL·min－1）和不同柱温（25、30、35℃），发现流速、柱温的改变对分离效果及含量结果影响不大；分别考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm） 柱、Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）柱、ZORBAX RRHD SB-C18（2.1×50 mm，1.8 um）柱及Hypersil GOLD C18（2.1 mm×50 mm，1.9 µm）柱，发现不同品牌型号的色谱柱对分离效果影响较大，最终选择了更合适的Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）柱进行检测分析。

本试验对血美安胶囊供试品溶液的制备方法进行了系统考察，比较了超声和回流两种提取方法，发现回流提取时溶液黏度大，不好滤过，因此采用超声处理方法，进一步对超声10、20、30、40、60 min 进行考察，发现超声提取30 min，所测成分基本提取完全，最终确定超声处理时间为30 min。试验过程中对乙醇、甲醇、80%乙醇、50%乙醇、水等不同浓度的提取溶剂进行了考察，发现80%乙醇作为提取溶剂时，提取率高，且水溶性多糖、蛋白质、淀粉不被溶出，分析时能避免其堵塞色谱柱，因此选择80%乙醇作为血美安胶囊供试品的提取溶剂。

本试验首次采用UPLC 法同时测定血美安胶囊中的4 种成分，结果所测4 批血美安胶囊样品没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的平均含量分别为3.03、1.50、4.78、4.13 mg·g－1，总量均大于13.0 mg·g－1，比原标准仅控制芍药苷和丹皮酚的含量更全面，建立的血美安胶囊含量测定方法简便、快速，重复性好，可为血美安胶囊的质量控制提供依据。