基于聚酰胺类树形分子前药的纳米给药系统在恶性肿瘤治疗中的应用

王悦，黄元政，朱丹丹，廉宝平，刘潇璇（中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，药物科学研究院高端药物制剂与材料研究中心，南京 210009）

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病，肿瘤的发生和发展机制复杂，其高侵袭、易转移等特性给相应的治疗及药物研发带来了巨大的挑战。小分子药物因其结构相对简单、价格低廉且结构体系庞大，一直在抗肿瘤药物开发和肿瘤的临床治疗中占据着重要的地位[1-2]。然而，小分子抗肿瘤药物的研发往往伴随着漫长的试验周期和巨大的淘汰比例，而临床上的小分子抗肿瘤治疗药物又通常存在诸如水溶性差、选择性差、毒性大或多药耐药等缺陷[3-5]。面对新化学实体的研发困境，利用前药策略对已上市药物进行二次开发或对临床试验药物的缺陷进行改进成为了抗肿瘤药物研发的新热点。

近年来，随着纳米技术在肿瘤药物递送领域的不断发展，高分子前药策略受到了越来越多的关注。与传统的小分子前药设计理念不同，高分子前药策略利用特异性连接臂将具有一定尺寸的高分子载体与活性药物共价偶联，并通过调控其组装行为和靶部位药物释放性能来构建纳米级前药。此策略可以有效结合前药策略和纳米给药技术的优势，增加药物体内循环稳定性，通过高通透性和强滞留效应[6]（enhanced permeability and retention effect，EPR 效应）提高药物在肿瘤组织的富集能力，进而突破小分子药物在肿瘤治疗过程中面临的诸多瓶颈，提高治疗效率。

目前，可用于前药构建的高分子材料种类繁多、性质各异，其中，树形分子因其独特的结构和性能被广泛关注。树形分子是一类具有树枝状结构的大分子，一般由核心、分支单元和末端基团三个部分组成，并以分支单元的增长次数表示其代数（一般表示为Gn）[7]。与其他用于前药构建的聚合物相比，树形分子高度可控的制备途径使其具有精确的分子结构和尺寸[8]；同时，树形分子本身较小的纳米尺寸使其具有良好的肿瘤组织渗透性[9]；此外，树形分子还通过高度支化的方式在表面引入了丰富的可修饰基团，这些表面基团不仅为键合活性药物或其他功能性修饰提供了基础平台[10]，还使得树形分子具有多价效应，进一步将表面的功能性协同放大。在开发的各类树形分子中，以聚酰胺-胺类[Poly（amidoamine），PAMAM]和肽类树形分子（peptide dendrimers）为代表的聚酰胺类树形分子是目前树形分子前药设计中应用最为广泛的结构类型。其中，部分研发的聚酰胺类树形分子及以其作为载体开发的前药已进入临床应用或正在进行转化[8]。例如，第一个基于聚赖氨酸（PLL）树形分子的药物SPL7013（VivaGel）已经在澳大利亚和欧盟批准上市用于治疗细菌性阴道病[11]；此外，Starpharma 公司开发的聚酰胺类树形分子-抗肿瘤药物多西他赛的前药（DEP-Docetaxel）最近的临床Ⅰ期试验数据显示，与活性药物多西他赛相比，多西他赛树形分子前药不仅能够增加药物的安全性，延长血浆半衰期；同时还能降低血药浓度峰值，增加整体的药物暴露量[12]。这些成功的案例促使研究人员对聚酰胺类树形分子前药的设计合成进行了愈加深入的研究。

然而，肿瘤组织独特的病理特征为树形分子前药的构建带来了诸多挑战。首先，由于肿瘤的异质性和复杂性，仅仅依靠EPR 效应不能有效地将药物转运到肿瘤组织内部；同时，肿瘤组织较高的间质压使得药物很难渗透到肿瘤组织的深部杀死肿瘤细胞[13-16]；此外，采用单一药物治疗肿瘤的策略常会导致耐药性的产生和肿瘤复发，临床上主要采用多药联合的治疗手段[17]。因此，迫切需要构筑一种多模式协同治疗的给药系统，用以改善肿瘤的治疗效果。基于此，借助聚酰胺类树形分子丰富的表面基团和精确的纳米结构，研究人员将其与诸多功能性有机材料或无机纳米粒等结合，进而开发出结构更加新颖且功能更加优异的纳米给药系统，以适应肿瘤复杂的微环境，并为实现肿瘤多模式联合治疗和诊疗一体化提供可能性。

本综述先简要介绍聚酰胺类树形分子前药的组成和结构基础，然后进一步系统阐述近年来以聚酰胺类树形分子前药为基础通过共价键合、非共价组装以及Janus 树形分子自组装方式构建的纳米给药系统的设计思路和应用策略（见图1）。

图1 聚酰胺类树形分子前药纳米递送系统构建策略Fig 1 Construction of nano-drug delivery systems based on polyamide dendrimer prodrugs

1 聚酰胺类树形分子前药的组成及结构基础

聚酰胺类树形分子前药主要是由树形分子、活性药物以及可控制药物释放的连接臂组成（见图2），在高分子前药设计中，这三种成分的选择尤为重要。

图2 聚酰胺类树形分子前药组成示意图Fig 2 Composition of polyamide dendrimer prodrugs

作为前药结构中的药物载体部分，聚酰胺类树形分子的结构和性质都会对前药的制备、生物学功能以及后续的各种修饰产生很大的影响，是前药分子设计的重要环节。聚酰胺类树形分子（如PAMAM 和peptide dendrimers）的结构中含有大量的酰胺结构，同时分子表面还拥有丰富的可供修饰的官能团-氨基，这种特殊的结构使得聚酰胺类树形分子具有良好的生物相容性和类蛋白特性，在生物医药领域得到了广泛的应用，特别是在作为药物载体用于前药的开发方面研究得尤为深入[18]。利用此类树形分子作为前药载体有利于改善母体药物在体内的吸收、分布、代谢、清除和毒性（ADMET），同时其拥有的大量表面官能团为药物的连接提供了数量丰富且灵活可变的结合位点。

活性药物是聚酰胺类树形分子前药发挥抗肿瘤作用的核心部分，整个树形分子前药的设计都是围绕药物的作用部位、作用机制以及药物自身存在的缺陷等方面开展。在前药的设计上，药物结构稳定性及是否具有可修饰官能团都是重要的考虑因素，其结构稳定性保证了在前药形成和解离过程中药物自身的生物活性不发生改变；其是否具有可修饰官能团则决定了该活性药物是否能进行前药的构建以改善其ADMET。在活性药物的结构中，常见的可修饰官能团包括氨基、羟基、羧基、羰基等[19]，这些官能团的种类将影响药物与树形分子之间敏感性连接臂的选择、设计以及控制药物释放的能力。图3列出了在树形分子前药设计中常被应用的一些抗肿瘤药物，其中大部分已被用于构建聚酰胺类树形分子前药（见图3）。

图3 常见用于构建聚酰胺类树形分子前药的活性药物Fig 3 Common active drugs for the construction of polyamide dendrimer prodrugs

在树形分子前药中，药物与树形分子之间的连接臂的选择能够在很大程度上决定药物在体内释放的位置和速度，进而决定树形分子前药在体内的安全性以及最终的抗肿瘤效果[20]。理想的连接臂应具有一定的动态稳定性，即在血液循环中保持相对稳定，而在到达肿瘤部位后，通过特定的刺激响应机制解离并按需释放药物。目前认为，肿瘤部位特殊的病理特征主要表现为：弱酸性（肿瘤组织中pH 为6.5～6.8，细胞的内涵体、溶酶体内的pH 为4.5～6.5）、多种酶类的高表达（基质金属蛋白酶、酯酶、α-淀粉酶、组织蛋白酶B等）、还原性物质[以谷胱甘肽（GSH）为主]和活性氧（ROS）水平较高、氧气缺乏等[12，21-22]。针对这些独特的肿瘤微环境特征，研究人员已经设计出了多种刺激响应性化学结构并将其应用于控制药物的精准释放。目前，在诸多响应性结构中应用较多的包括：弱酸性环境响应的腙键、亚胺键、顺乌头酰胺键等；酶响应的酯键、偶氮键、多种短肽类（GFLG 等）间隔物等；还原性物质GSH 响应的二硫键以及ROS 响应的缩硫醛（酮）键等（见表1）[23-37]。此外，还有一些乏氧响应的化学键、自毁型化学键，以及能够在外部光、温度等刺激下发生断裂的化学结构也已被成功开发并应用于树形分子前药的构建[38-39]。

表1 常见的用于构建树形分子前药的响应型连接臂的类型、结构及响应条件Tab 1 Type，structure and response of common responsive linkers for the construction of dendrimer prodrugs

2 以共价键合方式构建基于聚酰胺树形分子前药的纳米给药系统

共价键合是构建纳米给药系统的较为常用的策略之一，此策略构建的纳米给药系统通常具有较高的稳定性[40]。通过共价键合的方式在聚酰胺类树形分子前药中引入具有不同功能和特性的纳米材料、生物大分子，或直接将前药分子通过交联剂聚合，不仅能够构建基于小尺寸树形分子前药尺寸变换的纳米给药系统，增强EPR 效应以及药物在肿瘤组织的深层渗透，还能够结合其他治疗模式，进一步实现肿瘤的多功能协同治疗或诊疗一体化。

纳米给药系统的尺寸与其在肿瘤部位的聚集和扩散密切相关，较大尺寸的纳米给药系统更容易通过EPR 效应在肿瘤部位富集[41]。为形成尺寸更大的纳米结构，将聚酰胺类树形分子前药直接共价交联是最为有效的设计策略之一。基于此，Wang 等[29]首先利用丙烯酸酯结构将喜树碱（CPT）键合到G3 PAMAM 表面获得了树形分子前药，随后选用聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）作为交联剂与前药分子相互偶联形成了具有缓控释药能力的纳米递送系统（见图4A）。在生理条件下，丙烯酸酯结构能够在树形分子表面氨基的作用下缓慢降解并释放药物，而由酯键构成的交联剂使得整个凝胶体系在体内发生缓慢的降解，从而避免高分子药物载体在体内的过度累积。

然而，研究表明：尺寸较大的纳米粒子（100～200 nm）能够在肿瘤部位快速聚集，却难以接近远端的肿瘤细胞；相反，较小的纳米粒子（＜50 nm）虽然具有更好的深层渗透能力，但通常在肿瘤部位的蓄积不足[9，41-42]。为解决这一问题，研究人员利用不同机制设计了各种尺寸可变换的纳米给药系统。一方面，在前药共价交联构建给药系统的策略中使用具有肿瘤病理特征响应能力的交联剂，使得交联构建的大尺寸给药系统能在肿瘤微环境中释放小尺寸树形分子前药进入肿瘤组织深层发挥药效。例如，Hou 等[36]选择Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala 肽段作为交联剂，以共价键合的方式构建了一种基于树形分子前药的纳米凝胶系统，并借助静电相互作用力在其表面包覆透明质酸（HA），最终获得了一种具有特异性尺寸变换特性的纳米递送系统（见图4B）。该体系中HA 的包覆不仅能够提高药物生物相容性并延长血浆半衰期，还通过主动靶向作用使纳米颗粒更多地累积在肿瘤部位；多肽交联剂能够被肿瘤成纤维细胞上高表达的纤维细胞活化蛋白α（FAP-α）特异性切割，从而实现小尺寸树形分子前药的特异性释放，产生尺寸转变的效果；而由二硫键构建的前药分子则能够在肿瘤细胞内GSH 的刺激下有效释放出药物分子——阿霉素（DOX），从而产生显著的抗肿瘤效果。另一方面，也可以通过在树形分子前药体系中引入具有不同性质的纳米材料或生物大分子达到相似的目的。例如，Hu 等[28]将树形分子前药与明胶共价连接制备了一种同样具有尺寸变换机制的纳米给药系统。该研究首先在聚L-赖氨酸树形分子表面通过酸敏感的顺乌头酰胺键连接DOX，并修饰上聚乙二醇（PEG）和RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）靶向肽，获得了具有肿瘤靶向功能的树形分子前药（粒径约为30 nm）；然后将此前药共价连接到明胶（gelatin）表面形成了较大粒径的纳米给药系统（约为190 nm）（见图4C）。结果表明，前药键合明胶形成的给药系统在肿瘤部位的富集明显增加，到达肿瘤组织后，明胶能够被肿瘤组织中高表达的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）降解，使其能够解散并释放出树形分子前药，进而增加药物在肿瘤中的渗透能力。以上基于小尺寸树形分子前药共价键合构建尺寸可变的纳米给药系统的策略，充分利用了不同纳米尺寸的优势，增强了药物在肿瘤部位的富集及其对远端肿瘤细胞的渗透，提高了药物的疗效。

图4 通过共价键合构建的特异性尺寸转换的树形分子前药纳米给药系统Fig 4 Polyamide dendrimer prodrug-based on nanosystems with specific size converting function by covalent construction

此外，树形分子前药与不同功能的纳米材料键合构建的给药系统还能够应用于协同治疗和诊疗一体化的研究。例如，Li 等[25]将DOX 通过腙键装载到G4 PAMAM 树形分子上，然后将此前药与金纳米棒共价键合，构建了一种联合化疗和光热治疗的纳米粒子——PEG-DOX-PAMAM-AuNPs（见图5A）。当载药纳米粒子进入肿瘤细胞时，在内涵体酸性环境（pH 5.0）刺激下，药物快速释放杀伤肿瘤细胞；同时，给药体系中的金纳米棒还能够将吸收的近红外光转变成热量，进一步增强对肿瘤细胞的杀伤能力。与单一治疗手段相比，此化-光疗协同的纳米递送系统在体内外实验中均表现出了更好的治疗效果。而在另一项研究中，Chang 等[31]将紫杉醇（PTX）通过酯键键合到含有叶酸（FA）靶向基团的PAMAM 树形分子上，再将树形分子前药与超顺磁性氧化铁纳米粒子（IONP）通过配体交换反应共价连接，制备了一种可同时用于肿瘤治疗与诊断的纳米给药系统（见图5B）。此诊疗系统具有良好的生物相容性和血液稳定性，可通过EPR 效应特异性累积在肿瘤部位，并经由叶酸受体介导的内吞作用被肿瘤细胞快速摄取，从而起到杀伤肿瘤细胞以及肿瘤成像的作用。

图5 聚酰胺树形分子前药与无机纳米粒子共价键合构建的多模式纳米给药系统Fig 5 Multi-mode cooperative nanosystems constructed by polyamide dendrimer prodrugs and inorganic nanoparticles

采用共价键合方式构建的纳米给药系统具有相对较高的稳定性，能够应对复杂的体内环境并实现治疗目的。但是，由共价键结合的材料往往会受其本身性质的约束，合成条件复杂且纯化难度较大；同时，这些纳米给药系统的结构相对固定，可能会对材料自身的功能性产生一定的限制，从而影响治疗效果。

3 以非共价键结合方式构建基于聚酰胺树形分子前药的纳米给药系统

除了共价键合的方式以外，树形分子前药还可以通过非共价弱相互作用力与其他材料组装形成超分子纳米结构的给药系统。所利用的非共价作用力主要包括π-π堆积作用、电荷相互作用力、亲疏水作用和主客体相互作用等。与共价键合方式相比，由非共价作用力构建的纳米组装体具有动态可逆的特性，更易于进行特异性的尺寸、电性或形貌的变换，以适应不同体内环境的要求，实现多级响应性的药物输送。

树形分子前药所携载的药物往往为疏水药物，因而可以利用药物间π-π堆积作用以及疏水性质简单便捷地构建较大尺寸的给药系统，以促进药物在肿瘤部位的富集。例如，Zhang 等[33]将制备PEG 化的PLL 树形分子-DOX 前药组装形成粒径为60～90 nm 的超分子组装体，其能通过EPR 效应累积在肿瘤部位，在卵巢癌SKOV-3细胞的体内模型中显示出了比DOX 更高的抗肿瘤活性。

聚酰胺类树形分子自身具有良好的亲水性质，在递送系统构建中，这种亲水特性不仅使树形分子前药能够与疏水片段偶联形成两亲性分子，进而借助亲疏水作用组装构建尺寸可变的多级响应性纳米递送系统；还能够使前药进入脂质体的亲水空腔，通过包载的方式实现药物的按需递送。例如，Li 等[43]将顺铂通过还原敏感的连接臂键合到G4 PAMAM 树形分子上（粒径约为5 nm），再将疏水性的聚己内酯（PCL）通过肿瘤微酸环境敏感的连接键（2-丙酸基-3-甲基丁烯二酸酐（CDM）修饰到树形分子表面，从而获得了一种具有两亲性的树形分子前药；随后，通过亲疏水作用力，将前药分子与PCL、PEG 和聚己内酯的共聚物（PEG-b-PCL）共同组装为超分子给药系统（粒径约为100 nm）（见图6A）。进入血液循环后，这种超分子首先会在肿瘤部位蓄积；在进入肿瘤组织后，CDM 键响应肿瘤微酸环境发生断裂，组装体单元失去亲疏水性质，超分子解散，继而使顺铂-树形分子前药游离出来，以实现更好的深层渗透效果；顺铂-树形分子前药进入肿瘤细胞后，在胞内GSH 的作用下，释放药物，从而完成整个多级响应的过程，并在各种肿瘤模型中均表现出良好的治疗效果。此外，Satsangi 等[35]将紫杉醇-PAMAM 树形分子前药包载在带有FA 的脂质体中，制备了一种靶向给药体系（见图6B）。其中，紫杉醇和PAMAM 树形分子之间通过GFLG 短肽共价连接，在肿瘤细胞内高表达的组织蛋白酶B 的作用下会发生断裂，从而释放出药物；而包载前药分子的脂质体外壳能降低网状内皮系统（RES）对纳米粒子的清除作用，还能够特异性地靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞，增加药物在作用位点的蓄积，从而提高疗效。而Xiong 等[44]则利用相似的策略将顺铂-PAMAM 树形分子前药包载在带有RGD 环肽（cRGD）靶向肽的热敏性脂质体中，并在脂质层中负载光热剂吲哚菁绿（ICG），构建了一种能够在近红外光（NIR）照射下发生崩解的纳米给药系统（见图6C）。这种包载树形分子前药的脂质体能够通过EPR 效应和cRGD 的靶向作用富集在肿瘤部位，当其受到近红外光照射时，脂质层中的ICG 能够将获得的能量转化成热量从而提高局部温度，进而使热敏脂质体裂解，并释放出粒径约8 nm 的树形分子前药，实现药物在肿瘤组织的按需递送和深层渗透。

图6 通过亲疏水相互作用构建基于树形分子前药的纳米给药系统示意图Fig 6 Construction of polyamide dendrimer prodrug-based on nanosystems via hydrophilic and hydrophobic interaction

利用聚酰胺类树形分子的结构特点，通过静电相互作用构建纳米给药系统也是一项行之有效的设计策略。在生理条件下，PAMAM 和PLL 等聚酰胺类树形分子会因为大量的表面氨基而表现出正电性，这些密集的正电荷不仅能被带有阴离子的聚合物包覆，以起到电荷屏蔽、协同增效的效果；还能够借助电荷翻转，控制前药分子之间的聚集和离散。利用这种策略，Guo 等[45]在G4 PAMAM 树形分子表面同时键合了顺铂和DOX两种抗肿瘤药物，随后通过静电相互作用在前药分子上包覆了一层带有负电荷的HA，以此构建了可以用于联合治疗的纳米给药系统（见图7A）。这种超分子纳米材料构成简单可控，形成条件温和，不仅增加了前药分子的粒径，整合了HA 的功能，还能够屏蔽PAMAM 自身的表面正电荷，从而降低毒性和延长血浆半衰期。Xia 等[23]则利用静电相互作用设计了一种基于联合用药和免疫治疗的多功能纳米递送系统。该研究首先通过腙键将DOX 键合到G4 PAMAM 树形分子表面得到了树形分子前药，再利用静电相互作用将带有负电荷的免疫佐剂胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤寡核苷酸（CpG ODNs）附着在前药分子表面，随后选用带有负电荷的低分子肝素（LMWH）作为外壳包覆在整个前药分子和免疫佐剂上，完成树形分子前药给药系统（LMWH/PPD/CpG）的构建（见图7B）。其中，LMWH 是一种天然、可生物降解的多糖，其能够通过屏蔽PAMAM 树形分子表面的正电荷降低RES 对给药体系的清除以及前药分子的潜在毒性；抗肿瘤药物DOX 除了能够直接对肿瘤造成细胞杀伤作用，还能够诱导细胞的免疫原性死亡，从而使机体产生免疫反应，而免疫佐剂CpG ODNs 则能够协同并促进这一过程，使得这种多功能纳米给药体系统对黑色素瘤原发肿瘤和肺转移均具有较高的治疗效果。

通过敏感键的微环境响应，将电荷吸附作用转变为电荷排斥作用，从而快速地解散超分子体系，是非共价作用力构建给药系统中独特的设计策略。其中较为常见的方法是通过2，3-二甲基马来酸酐对一些含末端氨基的材料进行表面修饰，使其具有响应型电荷翻转功能，再将其与前药分子进行超分子组装，形成纳米给药系统。例如，Li 等[46-47]尝试使用2，3-二甲基马来酸酐分别修饰聚乙二醇-聚（2-氨基乙基-天冬酰胺）共聚物和聚乙二醇-聚（2-氨基乙基-天冬酰胺）-聚己内酯的三嵌段共聚物，成功得到了两种阴离子的嵌段共聚物，并将这两种嵌段共聚物分别与顺铂-PAMAM 树形分子前药通过静电相互作用组装成尺寸可变的纳米给药系统（见图7C）。这两种嵌段共聚物均能在肿瘤微环境中发生电荷翻转，暴露带正电性的氨基表面，产生静电斥力，进而释放出更有利于深层渗透和细胞摄取的Pt-PAMAM 前药，进入肿瘤细胞发挥药效。

图7 通过静电相互作用构建基于树形分子前药的纳米给药系统的示意图Fig 7 Construction of polyamide dendrimer prodrug-based on nanosystems via electrostatic interaction

通过非共价相互作用构建的纳米给药系统，能够借助分子结构特性进行自发的识别组装，所以形成条件温和，纯化便捷，同时也为结构功能的多样化提供了基础。但是，这种弱相互作用也相应地降低了超分子组装体在体内循环中的稳定性。

4 基于Janus 树形分子前药构建的纳米给药系统

在多数的树形分子前药设计中，较高代数的树形分子一般作为首选载体，这主要因为低代数的树形分子表面基团数量较少，载药量偏低。但高代数树形分子则往往存在合成难度大、生产成本高等缺陷，这也给树形分子前药的构建带来了诸多困难[48]。为了应对这一挑战，研究人员开发出了一类具有精确结构的低代数Janus 树形分子用于前药的构建。这类Janus 树形分子前药一般具有亲-疏水的不对称结构，可以通过亲疏水作用力自组装成尺寸更大、表面基团更密集的纳米颗粒，进而能通过EPR 效应富集在肿瘤部位。此外，得益于Janus 的结构，这类树形分子前药通常能具有至少两种不同的功能化表面，由此也能赋予这类树形分子以不同的性质。这些特殊的结构特点及其极佳的组装性能使得Janus 树形分子及其前药在生物领域极具应用潜力。

在Janus 树形分子前药的设计策略中，将疏水药物与亲水树状单元分别置于分子两端是一类常见的结构形式。与一般的树形分子类似，对于Janus 树形分子末端基团进行合理的结构修饰同样能够改善自组装后纳米给药系统的整体性质，使其能在体内更好地克服各类生理屏障，并将药物高效地递送至靶部位。例如，为了提高给药系统的靶向性，Miller 等[30]以PEG-树状聚β-谷氨酸偶联物作为亲水端，将PTX 通过酯键键合到PEG 链另一端作为疏水端，同时，将具有一定骨肿瘤靶向性的阿仑膦酸盐修饰到亲水性聚β-谷氨酸的表面，由此制备了一种具有靶向性的Janus树形分子前药，其在生理条件下可以自组装形成Janus 树形分子前药纳米胶束（见图8A）。此前药胶束表面的阿仑膦酸盐能特异性结合骨骼中的碱式磷酸钙，使其能靶向骨肿瘤并蓄积在肿瘤部位，在产生与游离的PTX 相当的抗肿瘤和抗血管生成活性的同时，又表现出比PTX 更好的安全性和更长的血浆半衰期。此外，为实现给药系统选择性的细胞穿透作用，Zhang 等[24，49]对一种由DOX 和树状聚赖氨酸构成的Janus 树形分子前药进行了表面修饰，首先在树状赖氨酸表面修饰上能增强细胞穿透作用的精氨酸，同时，为了能够特异性作用于肿瘤细胞，进而利用2，3-二甲基马来酸酐对表面的精氨酸进行了进一步修饰，由此构建的具有多羧基表面的Janus 树形分子前药。形成的酰胺键能够在血液循环中稳定存在，并于肿瘤微环境中快速解离（见图8B）。修饰后的Janus 树形分子前药在生理条件下能够进行自组装，形成带负电荷的纳米给药系统；该纳米给药系统在血液循环中具有较高的稳定性和较低的毒性，能通过EPR 效应累积在肿瘤部位，并能在肿瘤微酸环境的刺激下脱去表面的负电性修饰基团，暴露出原有的精氨酸表面基团，快速进入肿瘤细胞。此策略构建的纳米给药系统能够特异性地增强肿瘤细胞摄取，从而提高药物的疗效。

图8 聚酰胺类Janus 树形分子前药构建的纳米给药系统示意图Fig 8 Janus poly-amide dendrimer prodrugs-based on nanosystems

药物作为疏水端树状单元作为亲水端形成的Janus 前药分子一般稳定性较高，且药物本身不易泄漏，但通常载药量偏低。为进一步提高载药量，研究人员尝试将药物共价键合到本身具有两亲性质的树形分子表面，设计并制备了另外一种形式的Janus 树形分子前药。在此类Janus 树形分子的设计中，亲水端的选择尤为重要。因PEG 链自身良好的亲水性和生物相容性，常常被用于亲水端的构建。例如，Li 等[34]构建了以乙二胺为核心的不对称聚赖氨酸枝状物，其一端是G2 的PLL 树形分子，而另一端是G3 代的PLL 树形分子；随后在G2 PLL 树形分子表面键合PEG 作为亲水端，在G3 PLL 树形分子表面通过酶敏感肽GFLG 键合了多个DOX 作为疏水段，以此构建了一种组织蛋白酶B 响应的Janus 树形分子前药（见图9A）。这种前药分子能够在生理条件下自组装形成纳米组装体。与游离的DOX 相比，Janus 树形分子前药纳米给药系统不仅具有更长的半衰期，而且能够通过EPR 效应富集在肿瘤部位，并在乳腺癌模型中显示出了更高的肿瘤抑制和诱导凋亡作用。此外，为进一步提高疏水端的疏水性质，充分利用树形分子表面的可修饰基团，合成了一种由谷氨酸和赖氨酸构成的Janus 树形分子，并在谷氨酸末端共价键合了PEG 作为亲水端，在赖氨酸末端键合了疏水性的苯基甲酯结构作为疏水端，随后又通过腙键进一步在疏水端上键合抗肿瘤药物DOX，由此得到了一种Janus 树形分子前药（见图9B）[31]。这种Janus 分子能够通过自组装形成具有PEG 外壳的超分子纳米粒，且由于外层PEG 的存在而具有较长的血浆半衰期，能够通过EPR 效应富集在肿瘤部位，并在酸性环境下快速释放出DOX，进而有效地杀死肿瘤细胞。

除了使用亲水性聚合物PEG 作为亲水端外，可生物降解的水溶性天然多糖也能作为Janus 树形分子前药的亲水端。She 等[26]选用天然多糖肝素作为亲水端，设计了一种由肝素和聚赖氨酸树状单元构成的Janus 树形分子，并利用上述相似的策略将DOX 通过酸敏感的腙键键合在树状单元的末端构建前药分子（见图9C）。其中，肝素是一种天然多糖，可以通过与肿瘤相关因子（如选择素、肝素酶和生长因子）相互作用来抑制肿瘤的生长和转移。当这种Janus 树形分子前药自发组装形成纳米颗粒时，DOX 作为疏水端被包裹在内部，而肝素则会处于外层。前药分子能够在pH 5.0 的环境中快速释药，并在乳腺肿瘤模型中表现出了比游离的DOX 更强的抗肿瘤活性。

图9 表面药物修饰的自组装聚酰胺类Janus 树形分子纳米给药系统Fig 9 Self-assembly of surface drug-modified Janus polyamide dendrimer based nanosystems

此外，还可以选用疏水性的烷基链和亲水性的PAMAM 树形分子构建两亲性的树形分子，并将活性药物键合在树形分子表面以构建Janus 树形分子前药。基于这种设计，Zhou 等[50]利用酯键将核苷药物类似物连接到含有十八烷基疏水链的G2 PAMAM 两亲性树形分子表面，以此构建了两亲性Janus 树形分子前药。这种前药分子能够在较低的临界胶束浓度（CMC）下进行自组装，并通过酯酶降解释放药物。

由于Janus 树形分子前药自身具有的亲疏水特性，使其能够结合低代和高代树形分子前药的多种优势，结构精确，功能多变，是纳米给药系统的理想载体。但是，基于亲疏水作用力的纳米颗粒仍然存在稳定性不足，易在体内循环中解离的缺陷。

5 总结

树形分子前药因结合了树形分子和前药的独特优势而受到了研究人员的广泛关注。然而，肿瘤的异质性和复杂性给树形分子前药的构建带来了诸多挑战。本综述主要聚焦于以聚酰胺类树形分子前药为基础的纳米给药系统构建模式，分析总结了共价键合、非共价组装以及Janus 树形分子自组装三种设计策略。其中，共价键合的构建方式结构稳定，能够适应体内不同微环境的变化，获得良好的治疗效果；非共价相互作用的构建方式灵活多变，且形成条件温和，结构动态可逆，能够更好地实现多样化的体内功能；而基于Janus 树形分子的超分子组装体则综合了低代和高代数树形分子前药的优势，在保证结构精确的同时，还降低了合成难度，丰富了体系的多样性。这些纳米给药系统能够有效地调控组装行为、特异性地进行药物释放并结合不同的功能性材料，在控制药物释放、降低毒性、增强靶向作用等方面取得了极大的进展。但目前仍然存在一些急需解决的问题：如树形分子材料的工业合成难度；一些分子量较高的树形分子前药仍缺乏有效的表征手段；树形分子材料体内安全性的研究不足等。但随着研究的深入，这些问题在不久的将来都会被有效地解决，树形分子前药仍具有很大的临床应用潜力。