超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中金刚烷胺的残留量

◎ 刁玉华，张加稳

（昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650032）

金刚烷胺是饱和三环癸烷的氨基衍生物，属于三环胺类。1966年，人类首次研究发现金刚烷胺具有抗病毒的功效，其于1976年成为美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）首次批准的抗病毒药物，主要用于预防亚洲甲型流感病毒的感染，临床上还被用于治疗帕金森综合征、丙型肝炎和多发性硬化症[1-2]。大型流感的爆发会造成畜禽动物极高的发病率和死亡率，养殖户为降低经济损失，将金刚烷胺类药物添加至饲料中用于畜禽流感的预防和治疗，然而非法使用金刚烷胺类药物会造成动物体内药物残留，加大病毒的耐药性和变异性，人体食用后会损伤生殖系统[3-4]。因此，包括我国在内的多个国家已将金刚烷胺列为禁用药物，且2017年原农业部印发的《关于动物及动物产品兽药残留监控计划的通知》将其定为首个监控项目[5]。

目前，金刚烷胺的检测方法有高效液相色谱法[6-7]、气相色谱法[8]、酶联免疫法[9]、电化学法[10]、微流控芯片法[11]和高效液相色谱-串联质谱法[12-13]等。高效液相色谱-串联质谱法已经成为近年兽药残留检测分析的主要方法，具有灵敏度高、基质干扰小、高通量及定性定量更准确等优点。查阅文献可知，关于肉制品中金刚烷胺残留量检测的相关报道较多[14-16]，提取溶剂多采用甲醇或乙腈与有机酸混合提取，而进出口行业标准《出口动物组织中抗病毒类药物残留的测定液相色谱-质谱/质谱法》（SN/T 4253—2015）[17]仅以三氯乙酸作为提取溶剂，提取液均用混合阳离子固相萃取柱净化，实验验证后发现上述方法的提取效率和重现性均不理想，而关于其他提取溶剂和固相萃取柱的相关研究报道又较少。故本实验选取市售鸡蛋为基质样品，分别对提取溶剂、固相萃取柱进行优化研究，最终建立了系统的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，可为鸡蛋中金刚烷胺残留量的检测分析提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯及异丙醇，均为色谱纯，购自默克股份两合公司；甲酸、乙酸、三氯乙酸、盐酸、氨水、乙酸铵，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

材料：金刚烷胺标准品（中国食品药品检定研究院），Cleanert C18、Oasis HLB、PCX、MCX、SCX、WCX共6种固相萃取柱（均为天津博纳艾杰尔科技有限公司），BHE Amide色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美国沃特世公司）。

1.2 仪器与设备

QTRAP 4500超高效液相-三重四级杆串联质谱仪（配有电喷雾离子源ESI及MultiQuant3.0.2数据处理系统，美国AB SCIEX公司）、JJ500电子天平（常熟市双杰测试仪器）、SK8210HP超声波清洗仪（上海科导）、Reacti-Therm氮吹仪（美国赛默飞世尔公司）、arium® comfort II超纯水机（德国赛多利斯公司）、S220K精密pH计（梅特勒-托利多公司）。

1.3 方法与过程

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取金刚烷胺标准品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度配制成100 μg·mL-1的标准储备液，4 ℃冰箱中避光保存备用。

取100 μg·mL-1的 标 准 储 备 液 用 乙 腈 配 制 成1 μg·mL-1标准使用液，用30%乙腈稀释标准使用液为5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1的系列标准溶液，待用。

1.3.2 样品前处理

（1）实验样品制备。选取市售鸡蛋去壳用组织捣碎机捣碎，装入自封袋中，冷藏、避光保存，备用。

（2）提取。准确称取均匀试样5 g，于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈-2.0%三氯乙酸溶液（1∶1，V/V），漩涡混匀3 min，再超声提取10 min，8 000 r·min-1离心5 min，取出上清液，再重复提取一次，离心后合并上清液至25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度待净化。

（3）净化。依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸活化混合阳离子交换固相萃取小柱，准确移取5 mL稀释液过柱，依次用5 mL甲酸溶液、3 mL1%甲酸乙腈淋洗，弃去全部流出液；用2×2 mL甲醇-氨水-乙酸铵（95+2.5+2.5）洗脱至10 mL试管中，在40 ℃下用氮吹仪吹至近干。准确加入1.0 mL乙腈-甲醇-水（70+10+20）溶解残渣，过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 液相色谱-串联质谱条件

（1）液相条件。流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相A为含0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱条件表

（2）质谱条件。ESI-MS/MS条件：正离子扫描；MRM多反应监测；气帘气流速为38 L·h-1，离子源雾化气流速为55 L·h-1，离子源辅助加热气流速为55 L·h-1，喷雾电压5 500 V，加热器温度为550 ℃；优化后的相关参数见表2。

表2 金刚烷胺保留时间及质谱参数表

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

金刚烷胺分子结构中含有胺基基团，在质谱检测离子化过程中，容易形成稳定的[M+H]+离子，故采用电喷雾正离子（ESI+）扫描模式。正离子扫描模式下，在液相色谱流动相中加入少量的甲酸会增强待测化合物的响应强度，原因是甲酸会电离出更多的H+，因此本实验选用0.1%的甲酸水溶液与乙腈为流动相，由于金刚烷胺含有胺基基团，极性较强，故采用BHE Amide色 谱 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Waters）进行梯度洗脱，保证有较好的峰形和响应强度。建立优化后的液相色谱参数和质谱参数后对加标样品溶液采集的离子色谱峰图分别如图1所示。

图1 金刚烷胺加标溶液的MRM离子色谱图

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

金刚烷胺分子结构含有胺基，极性较强，根据相似相溶原理，易溶于强极性有机溶剂中，故本实验分别比较甲醇、乙腈、异丙醇、二氯甲烷以及乙酸乙酯等不同极性的有机溶剂分别与2.0%的甲酸、乙酸、盐酸和三氯乙酸等以1∶1体积混合进行提取。其中，异丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作为提取溶剂的提取效果最好，原因可能是金刚烷胺的极性与异丙醇相似，且三氯乙酸可沉淀蛋白，减少基质干扰，因此本实验选用异丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作为提取溶剂。

2.2.2 净化柱的优化

金刚烷胺分子结构中含有胺基，在酸性条件下呈阳离子状态，故目前实验室多采用阳离子交换固相萃取柱对提取液进行净化。本实验分别比较了MCX、PCX、SCX、WCX、HLB和C18固相萃取柱对目标物提取液的净化效果，实验结果如图2所示。

图2 不同固相萃取柱净化下金刚烷胺的提取回收率图

由图2可知，采用Oasis MCX比其他5种固相萃取柱净化回收率高，原因可能是其填料对金刚烷胺所形成的[M+H]+离子吸附作用较强，且易于洗脱，因此本实验选择Oasis MCX作为固相净化柱。

2.3 校准曲线、检出限和定量限

金刚烷胺的质量浓度在5.0～100.0 ng·mL-1时，其目标物定量离子对的峰面积与其质量浓度的线性关系良好，相关系数为0.999 1，线性回归方程为y=48 324x +174 820。以信噪比S/N=3时对应的浓度作为方法的检出限，信噪比S/N=10时对应的浓度为定量限，得到金刚烷胺的检出限为0.3 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

在空白样品中分别添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13个浓度水平的金刚烷胺标准溶液，每个水平进行6次平行实验，按照优化的实验方法测定，计算其加标回收率及精密度。

实验结果见表3，加标样品中金刚烷胺的平均回收率为87.5%～97.6%，相对标准偏差均小于6%，GB/T 27404—2008规定被测组分含量小于100 μg·kg-1，回收率为60%～120%、精密度21%～30%[18]，可见本方法加标回收率和精密度较好。

表3 样品加标回收率实验结果表（n=6）

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定鸡蛋中金刚烷胺残留量的分析方法。分别对提取溶剂、固相萃取柱、仪器条件做了优化研究，优化后的实验方法为以异丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）为提取溶剂、以Oasis MCX为固相萃取净化柱对样品进行前处理，再以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，采用ESI正离子模式电离，多级反应监测（MRM）进行检测。实验结果显示，本方法相关系数为0.999 1，检出限为0.3 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1，回收率为87.5%～97.6%，相对标准偏差均小于6%。可见该方法操作简便、快速，前处理干净，基质干扰小，回收率高、重复性好，满足大批量禽蛋中金刚烷胺残留量的检测分析。