胶质母细胞瘤组织Asporin表达变化及其与患者替莫唑胺耐药、预后的关系

郑向荣，杨洪安，丁锋

山东第一医科大学附属省立医院神经外科，济南250021

胶质细胞瘤是一种常见的颅内原发性肿瘤，占所有颅内肿瘤的50%以上，世界卫生组织（WHO）根据其恶性程度及病理特征分为Ⅰ～Ⅳ级［1］。胶质母细胞瘤（GBM）是最常见、侵袭性最强、预后最差的中枢神经系统肿瘤，属于Ⅳ级胶质瘤，即使采取手术切除+放化疗的传统综合治疗策略，中位生存期仍然不到18个月，3年生存率<10%［2-3］。目前，分子靶向治疗是肿瘤治疗研究领域中的热点，而分子治疗靶点的选择是基础和关键。牙周韧带相关蛋白-1（Asporin）在骨与软骨疾病进展中发挥重要作用，近年研究证实其能促进多种肿瘤的恶性进展，但在胶质瘤中的研究鲜有报道。本研究观察了Asporin在GBM组织中的表达变化，并分析其与GBM患者替莫唑胺（TMZ）耐药和预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年10月—2015年10月山东第一医科大学附属省立医院神经外科收治并经术后病理确诊的GBM患者40例，男18例，女22例；年龄（52.3±10.1）岁；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性23例（57.5%），阴性17例（42.5%）；少突胶质细胞转录因子-2（Olig-2）阳性16例（40.0%），阴性24例（60.0%）；P53阳性21例（52.5%），阴性19例（47.5%）；IDH1阳性13例（32.5%），阴性27例（67.5%）。另选10例高血压脑出血患者，男5例，女5例；年龄（49.5±9.3）岁。手术留取GBM患者和高血压脑出血患者（为减轻颅内压所切除的正常大脑组织）脑组织标本。本研究均经患者知情同意并签署知情同意书，且通过了山东第一医科大学附属省立医院伦理委员会的评议。

1.2 主要试剂及仪器 Asporin抗体（Abcom公司，美国）；GAPDH抗体（中杉金桥公司，中国）；免疫组化试剂盒、苏木素、柠檬酸盐修复液、磷酸盐缓冲液（PBS）、中性树胶、DAB试剂盒（中杉金桥公司，中国）；一抗稀释液（北京索莱宝公司，中国）；RIPA裂解液、PMSF、5×蛋白上样缓冲液、1.5 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10%SDS、30%Acr-bis、过 硫 酸 铵（APS）、1 mmol/L Tris-HCL（pH 6.8，碧云天公司，中国）；蛋白Marker、BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；脱脂奶粉（内蒙古伊利公司，中国）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（中杉金桥公司，中国）。ECL发光液、PVDF膜（Millipore公司，美国）；显影液、定影液（乐凯胶片公司，中国）；胶片（柯达公司，美国）。

1.3 脑组织Asporin蛋白检测 ①Western blotting法：提取GBM组织和正常脑组织的总蛋白，采用BCA蛋白定量分析试剂盒检测蛋白浓度，蛋白变性后每个上样标本采用40μg总蛋白，进行电泳分离，电转至PVDF膜后5%脱脂奶粉封闭，Asporin（1∶1 000）及GAPDH（1∶1 000）抗体4℃孵育过夜，次日洗膜后行二抗孵育，TBST洗膜后暗室曝光，采图。用Image J软件测量谱带的光密度，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。②免疫组化染色法：对GBM组织和正常脑组织标本进行Asporin免疫组化染色，明确Asporin在正常脑组织和GBM标本组织中的表达情况。实验方法简述如下：切片、烤片、脱蜡并水化，高压抗原修复，山羊血清封闭，抗体孵育，DAB显色，苏木素复染，树胶封片，免疫组化结果评分。染色评分根据阳性细胞比例得分和染色深度得分相乘得到［13］，没有阳性染色计0分，1%～10%阳性细胞或浅黄色染色记1分，11%～50%阳性细胞或深黄色染色记2分，51～75%阳性细胞或棕色染色记3分，>75%阳性细胞或深棕色染色记4分；总分≤4为低表达，总分≥6为高表达。

1.4 Asporin表达与GBM患者TMZ耐药关系分析 17例GBM患者进行了基因检测，O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化提示对TMZ敏感，MGMT启动子未甲基化提示对TMZ耐药。针对这17例患者行Asporin高低表达分组，通过χ2检验进行耐药性分析。

1.5 Asporin表达与GBM患者预后关系分析 依据免疫组化染色得分将Asporin表达分为高、低表达组，总分≤4为低表达组，总分≥6为高表达组。然后采用Kaplan-Meier法比较Asporin高表达组、低表达组患者预后情况。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各脑组织Asporin表达比较 GBM组织、正常脑组织Asporin相对表达量分别为1.90±1.20、0.34±0.20，免疫组化染色得分分别为（8.01±4.38）、（2.00±1.15）分，两者比较，P均<0.05。Asporin在各脑组织中的表达情况见图1。

图1 Asporin在各脑组织中的免疫组化染色图像

2.2 Asporin表达与GBM患者TMZ耐药的关系 17例GBM患者中12例患者MGMT启动子未甲基化（对TMZ耐药），5例患者MGMT启动子甲基化（对TMZ敏感），耐药者、敏感者Asporin相对表达量分别为3.07±0.61、1.04±0.18，两者比较，P<0.05。17例GBM患者根据免疫组化染色评分分为Asporin高表达者（13例）、Asporin低表达者（4例），对TMZ耐药例数分别为10、2例，两者比较，P<0.05。

2.3 Asporin表达与GBM患者预后的关系 30例GBM患者根据Asporin染色评分分为高表达者（27例）、低表达者（13例），中位生存期分别为（12.0±0.7）、（23.0±3.9）个月，两者比较，P<0.05。

3 讨论

GBM是颅内最常见、侵袭性最强、恶性程度最高的原发性肿瘤，呈浸润性、侵袭性生长，即使术中采取扩大切除的手段，往往也无法完全切除肿瘤，况且脑组织功能的重要性决定了大多数胶质瘤仅能进行极其有限的扩大切除，还有相当数量的胶质瘤侵犯了丘脑或脑干等重要部位，仅能切除部分肿瘤甚至无法手术治疗［3-4］。TMZ是临床治疗GBM的标准一线化疗药，主要攻击肿瘤细胞DNA，可引起DNA上MGMT发生甲基化，进而导致DNA交联、断裂，产生细胞凋亡，然而由于多数患者在化疗过程中极易对TMZ化疗产生耐药，因此目前临床上亟需寻找新的GBM治疗靶点［5］。

Asporin是一种细胞外基质蛋白，最初研究发现其在多种骨关节疾病中发挥重要作用。近年来，Asporin在肿瘤中的作用开始受到重视。多项研究证实，Asporin在多种肿瘤及肿瘤相关性纤维母细胞（CAFs）中呈高表达，并通过自分泌或旁分泌方式促进肿瘤的恶性发展［6-8］。SATOYOSHI等［6］发现，CAFs分泌的Asporin能通过活化CD44-Rac1信号轴增加胃癌细胞和CAFs自身的侵袭能力。研究发现，Asporin在胰腺癌细胞和间质中均呈高表达，其可通过自分泌和旁分泌两种方式与胰腺癌细胞表面的CD44受体结合，激活AKT和ERK通路促进胰腺癌的侵袭和迁移［7］。上述研究表明，Asporin往往通过与CD44受体结合发挥生物学作用进而促进肿瘤的恶性进展。然而，Asporin在胶质瘤中的表达及生物学功能目前尚无研究报道。本研究发现，Asporin在正常大脑组织中不表达，而在GBM组织中普遍呈中高表达，因此我们初步推测，Asporin有可能在GBM中发挥着重要的生物学功能，而后续的研究也进一步验证了我们的推测。

MGMT是一种DNA修复酶，可通过转移TMZ造成的DNA甲基化，避免TMZ导致的DNA发生交联、断裂，从而参与GBM对TMZ的耐药，同时自身不可逆的失活，即“自杀式”修复机制［9］。研究［10-11］表明，MGMT启动子甲基化的患者与未甲基化的患者相比能从TMZ化疗中获得的更好的治疗效果，前者的中位生存期为21.7个月，而后者中位生存期仅为12.7个月，因此MGMT是目前临床上预测TMZ是否耐药的关键分子。本研究收集的40例GBM患者中17例患者曾行MGMT基因检测，其中12例患者MGMT启动子未甲基化，5例患者MGMT启动子甲基化，Asporin在TMZ耐药GBM患者中表达水平更高，且Asporin高表达与MGMT非甲基化间存在明显的相关性，提示Asporin可能参与了GBM患者对TMZ耐药生物学过程，但具体机制目前尚不清楚，有待进一步研究。进一步分析Asporin表达水平与GBM患者预后之间的关系，我们发现Asporin表达水平越高，GBM患者预后越差。文献［12］报道，CD44在GBM生长、复发和耐药中起重要作用，检测CD44表达水平可预测GBM的复发和耐药。临床上多数GBM患者在化疗过程中会对TMZ产生耐药，GBM患者术后中位生存期不到18个月，因此TMZ耐药是临床上亟待解决的问题，已成为近年来胶质瘤领域的研究热点［13-15］。目前研究初步发现，信号通路异常、非编码RNA、DNA损伤修复机制、肿瘤微环境、信号通路异常、胶质瘤干细胞学说、肿瘤细胞自噬等参与了替莫唑胺耐药，但参与调控TMZ耐药的具体机制尚未完全阐明，结合前期结果及相关文献报道，我们推测Asporin可能通过CD44促进替莫唑胺耐药，进而影响了GBM患者的预后，但具体机制有待进一步研究［16］。而进一步阐述TMZ的耐药分子机制有助于提高TMZ对GBM患者的治疗效果，为克服TMZ耐药提供新的理论依据。

总之，GBM组织Asporin的表达升高，Asporin表达水平越高，对TMZ耐药者越多，患者预后越差。