斑马鱼Slc26A4基因敲除品系的构建

赖若沙谢缤灵邓慧玲付贵芳刘嘉伍伟景谢华平谢鼎华*

1中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科(长沙410011)

2动物肠道功能调控湖南省重点实验室(长沙410081)

3动物营养与人体健康实验室(长沙410081)

4淡水鱼类发育生物学国家重点实验室(长沙410081)

SLC26A4是大前庭水管综合症(enlarged vestibular aqueduct syndrome,EVAS)的致病基因，也是中国第二位致聋基因[1,2]。SLC26A4基因编码一种由780个氨基酸和12个或更多的跨膜域组成的跨膜蛋白--pendrin。Pendrin是一种跨质膜交换阴离子蛋白，主要参与甲状腺中的Cl-/I-交换和内耳中的Cl-/HCO3-交换，后者在胚胎后期和出生后早期的内耳发育中至关重要。SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性遗传的Pendred综合征(PS)，包括甲状腺肿、听力丧失和前庭导水管增大[3]。

内耳由耳蜗、前庭和内淋巴囊组成[4]，内淋巴液位于内耳膜迷路内，具有其独特的离子组成[5]。稳定的内淋巴离子环境是正常听力和前庭功能所必需的，它受到内耳细胞中表达的各种离子通道、转运体和泵的调节。Pendrin是Cl-/HCO3-交换阴离子交换剂，表达于内耳的上皮细胞，对内淋巴离子环境的稳态非常重要[6-8]。

目前已有SLC26A4致聋机制的小鼠模型，包括基 因 敲 除 小 鼠（Slc26A4Δ/Δ），基 因 敲 入 小 鼠（Slc26A4tm1Dontuh/tm1Dontuh），和 一 个 ENU 诱 发 的Slc26A4loop/loop突变小鼠和几个转基因模型[9]。这些小鼠模型因为先天缺乏功能性pendrin，表现为重度听力丧失和前庭功能障碍，并伴有内淋巴间隙增大[9,10]。近年来，斑马鱼已经成为研究鱼体内离子调节的强大模型[11]。斑马鱼和人类基因有高达87%的同源性，并且能够在胚胎中进行基因沉默实验[12]。成年斑马鱼具有极高的亲和力和高容量Cl-摄取机制，该机制可根据环境变化进行调节[13]。因此，在描述内耳的Cl-/HCO3-交换的分子机制方面，斑马鱼比其他物种具有显著的优势。

为了研究Slc26A4基因在斑马鱼内耳发育过程中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Slc26A4基因敲除品系，对于EVAS的病理机制的理解和新的防治方案的研发具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

TU品系斑马鱼来自本实验室。水温28℃，pH值在6.5～ 7.5，14h光照/10h黑暗交替循环。胚胎在28.5℃的E3水中培养，第5天开始喂食草履虫至2周左右，之后转移至养殖系统架上喂食丰年虫。

1.1.2 主要试剂

引物由擎科生物合成，DNA marker，PCR高保真酶购自擎科生物，琼脂糖购自BBI公司，PCR产物纯化试剂盒购自生工生物，体外转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，RNA纯化试剂盒购自Qiagen公司，Cas9蛋白购自ThermoFisherScientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 sgRNA靶位点设计

首先在Ensembl网站上（http://www.ensembl.org/index.html）获取目标基因的完整序列，各个转录本以及内外显子等信息；找出所有紧邻5‘-NGG-3’（PAM）的候选靶序列，靶序列一般大小为18～ 20bp。sgRNA引物序列F基本结构：靶序列前加保护碱基（gcg）和T7启动子[11]（TAATACGACT‐CACTATA），靶序列后加sgRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG），R：（AAGCACC‐GACTCGGTGCCACT），根据Slc26A4基因靶位点通过Primer3.0设计基因组正反检测引物GSlc26A4-F和GSlc26A4-R（表1）。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Table 1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 sgRNA的合成

以Template DNA为模板[11]，sgRNA1-F/sgRNAR或sgRNA2-F/sgRNA-R为正反引物，退火温度为58℃，延伸时间为10s，用高保真酶进行PCR扩增，获得携带T7启动子的Slc26A4基因靶位点序列1及序列2的sgRNA模板序列；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，以回收的PCR产物作为模板，用T7体外转录试剂盒合成sgRNA，转录产物用RNA纯化试剂盒进行纯化回收，-80℃保存。

1.2.3 显微注射以及靶位点有效性检测

收集15 min内产的斑马鱼受精卵，待发育至1细胞期，将Slc26A4基因靶位点的sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按合适比例混匀，注射到斑马鱼受精卵中，随后置于28.5℃的恒温箱中培养；受精卵发育至36hpf挑选部分胚胎进行基因敲除的有效性鉴定，剩余胚胎继续培养至成鱼。

1.2.4 可稳定遗传突变体的筛选

将注射后的胚胎培养至2个月左右发育为幼鱼，并对幼鱼逐条剪尾进行基因型鉴定。由于两个靶位点之间相距145 bp，如果两个靶位点都有效，就会造成较大片段的缺失。用检测引物对基因组进行PCR扩增，随后进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR产物会同时出现473bp的野生型目的条带，以及比野生型目的条带小100bp左右的条带，则这些幼鱼为携带突变的F0代鱼；将F0代幼鱼继续饲养1个月左右至成鱼，与野生型进行杂交，用同样的基因型鉴定方法筛选出可稳定遗传的鱼，这些鱼为F1代突变体。基因型鉴定后，将F1代突变体中比野生型目的条带小的DNA条带进行切胶回收，并送公司测序并分析。

2 结果与分析

2.1 Slc26A4基因结构域分析

在https://www.ncbi.nlm.nih.gov查找斑马鱼Slc26A4基因信息，利用SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de）分析蛋白质结构域（图1）。

图1 SLC26A4蛋白结构域分析Fig.1 Analysis of SLC26A4 protein domain

2.2 Slc26A4基因靶位点确定

按1.2.1所述的方法在Slc26A4上选择敲除位点（见图2），靶位点序列前加保护碱基和启动子序列，靶位点序列后加sgRNA骨架上游序列，将此作为正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。sgRNA骨架下游序列作为反向引物sgRNA-R。

图2 Slc26A4基因靶位点示意图。Slc26A4基因的部分序列，大写加粗部分为外显子，小写未加粗部分为内含子；下划线为波浪线的表示靶位点序列，下划线为双直线的表示为PAM序列；下划线为直线的则是检测引物。Fig.2 The diagram ofSlc26A4gene targeting site.Above is partial sequence of theSlc26A4gene.The capitalized with bold sequences are exons,the lower case with bold parts are introns；The sequence with wavy line indicated the target site1 and target site2 sequence,respectively;the doubled underlines showed PAM sequence.Underlined by single lines are prim‐ers for genotyping.

2.3 Slc26A4基因注射有效性检测与分析

为了检验靶位点的有效性，本文按方法1.2.3中所述将注射后胚胎进行基因型鉴定，结果显示，2号和6号泳道除了野生型条带外，下方有一条小带，证明暗示选择的这两个靶位点都有效（见图3）。

图3 sgRNA有效性分析。PCR电泳图。M：DNAmarker；1：对照；2～ 6：注射胚胎PCR产物。2和6泳道除了有一条野生型条带外，下方有一条小带(黑色箭头指示)，证明两个靶位点都有效。Fig.3 Effectiveness analysis of sgRNA.Gel electrophoresis of PCR products.M:DNA marker;1:Control;2～ 6:PCR products injected with sgRNA.In addition to a wild-type band in lanes 2 and 6,there is band(indicated by a black arrow‐head)below,indicating that both target sites work.

2.4 F0代突变体筛选

将剩余胚胎养至成鱼并做基因型鉴定（见图4）。结果显示2、3、6、7以及8号成鱼携带突变基因。

图4 F0代幼鱼筛选。M：DNAmarker；1：野生型对照；2～ 8：幼鱼剪尾提取基因组DNA进行PCR扩增的产物。2、3、6、7以及8号泳道除了野生型条带外，下方有一条小带(黑色箭头指示)。Fig.4 F0 juvenile screening.M:DNA marker;1:Control;2～ 8:PCR products using juvenile genomic DNA injected with Slc26A4 sgRNAs.In addition to a wildtype band,lanes 2,3,6,7 and 8 have a smaller band(black arrowhead indicated).

2.5 稳定遗传突变体的筛选

本试验将筛选到的F0代突变体与野生型斑马鱼杂交，得到F1代，收集F1代胚胎，进行DNA鉴定，结果显示F0代突变体可稳定遗传（图5a）。随后将较小的条带回收并送测序，峰图显示两个靶位点都出现缺失(图5b)，测序结果证明两个靶位点都有效并造成大片段的缺失，结果如图5c。将剩余的F1代胚胎养至2个月的幼鱼，再逐条剪尾进行基因型鉴定（图5d），获得到可稳定遗传的F1代鱼，说明敲除品系构建成功。

图5 F1代突变体筛选。a.F1代基因型鉴定电泳图。M：DNAmarker；1：对照；2～ 14：注射胚胎sgRNA后，提取基因组 DNA，进行PCR扩增的产物。第13号泳道除了野生型条带外，下方有一条小带(黑色箭头指示)。b.F1突变体成鱼PCR产物凝胶电泳。M：DNAmarker；1：对照；2～ 13：注射胚胎基因组DNA进行PCR扩增的产物。第2、13号泳道除了有野生型条带外，下方有一条小带(黑色箭头指示);c.F1代胚胎PCR产物测序峰图，峰值图中：“——”代表靶位点1序列；d.测序序列比对结果。Fig.5 F1 generation mutant screening.a:Gel electrophore‐sis of F1 embryogenotyping.M:DNA marker;1:control;2～ 14:PCR products using genomic DNA injected with sgRNA.In addition to a wild-type band,thereis a smaller band in lane 13(indicated by the black arrowhead);b):Gel electrophoresis of PCR products of F1 mutant.M:DNA marker;1:control;2～ 13:PCR product injected with embryo genomic DNA.In ad‐dition to a wildtype band,there is a smaller band in lanes 2,13(Indicated by the black arrowhead);c:The F1 mutant se‐quencing result,the smaller band of PCR product was puri‐fied and sent for sequencing,“——”indicated the first tar‐get site sequence;d:Sequence alignmentresult.

3 讨论

EVAS是儿童感音神经性耳聋中最常见的病因之一，EVAS患者听力损失具有延迟发作和进行性发展的特点，这为临床进行干预提供了治疗时间窗，尤其对于语言能力习得阶段的婴幼儿来说至关重要[2]。研究小鼠模型发现，内耳内淋巴囊增大、内淋巴液酸化是听力丧失发病机制中的早期事件[9]。因此，EVAS的听力损失机制研究将集中在耳蜗发育过程中液体运输及离子交换，以及耳蜗细胞和分子功能改变[2]。这些研究结果可以指导制定相应的治疗方案，以最大限度地保留SLC26A4突变患者的听力。

人体有一些器官是利用充满液体的腔体来分隔生化和生物物理环境，并发挥相应功能的，如眼睛、脑室及内耳。病理情况下由于房水产生或引流减少而引起的眼压不稳定可导致失明，如高渗性黄斑病变或青光眼；而脑室静水压力不稳定与脑积水和精神障碍有关；同样，内耳压力不稳定会导致耳聋和平衡障碍，如EVAS和梅尼埃病。膜迷路中内淋巴压力的正常调节对我们的听觉和平衡感至关重要，而内淋巴囊及蜗管的存在有助于这种调节。然而，内淋巴囊是如何发挥其作用的尚不太清楚。内耳被包裹在人体最密集的岩骨中，因此很难被研究。而斑马鱼的内耳结构在骨头形成之前就开始工作了，易于注射和显微镜观察，因此Winburne[14]等人利用了斑马鱼胚胎的内耳进行研究，并发现当内耳压力升高时，内淋巴囊慢慢充满淋巴液，然后迅速释放。而鱼的基因突变会阻止囊腔收缩，导致囊腔过度膨胀，而这些变化与听力和平衡障碍患者相一致。这些结果表明斑马鱼可以作为很好的模型，来研究内耳发育过程中Slc26A4在内淋巴囊增大、内淋巴液酸化的中发挥的作用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来颇受关注的新技术，该技术由两部分组成，CRISPR结构骨架序列和Cas9蛋白。CRISPR结构骨架序列由前导序列、Cas基因、CRISPR基因座共同组成，具有招募Cas蛋白作用[15]。Cas9蛋白能结合到靶序列处特异性切割DNA双链。CRISPR基因座经过转录加工后，得到成熟的CRISPR RNA即crRNA，而crRNA与反式激活的crRNA即tracrRNA能形成一种嵌合RNA，该嵌合RNA与Cas9蛋白形成复合物，从而切断基因组DNA[15,16]。后经改造，将crRNA和tracrRNA改造成一个sgRNA（sequencespecific guide RNA）[17]，sgRNA与靶序列进行碱基配对，从而引导Cas9蛋白结合到靶序列处行使DNA切割功能。目的基因靶位置序列的3’端有原间隔序列相邻基序PAM（protospacer adjacent motifs），为5‘-NGG-3’序列，这是Cas9蛋白的识别位点。最后，通过改变sgRNA序列，体外合成sgRNA，Cas9蛋白可以靶向切割目的基因，从而达到基因敲除目的[18,19]。

CRISPR/Cas9基因编辑技术面世之前，基因编辑的方法有锌指核酸酶技术（Zinc-finger nucleas‐es，ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN），但ZFN基因打靶技术操作过程繁琐，周期长[15,20]。CRISPR/Cas9基因编辑技术比前两种技术简单，高效，一经面世，就被广泛应用。本研究采用Cloning freeCRISPR/Cas9基因编辑技术，简化了基因敲除的过程，提高了试验效率。本文采取大片段的缺失敲除的方法，敲除结果可经过琼脂糖凝胶电泳中直接观察到，方便了后续的实验操作。因为F0代胚胎为嵌合体，其突变不一定能够遗传到下一代，利用PCR直接筛选大片段缺失的突变体，将携带突变的个体与野生型杂交产生F1代，对F1代胚胎进行基因型鉴定，随后纯化回收、Sanger测序，确定敲除位点。

F1代突变体能够稳定遗传，将F1代杂合子自交，经基因型鉴定，约25%的子代为纯合子，与预期结果相符合。将F1杂合子自交，观察F2代纯合突变胚胎，其外表未出现明显缺陷（图6），这说明基因敲除后不影响整体胚胎发育，但是该基因是否引起细微结构改变、离子通道功能是否正常尚不清楚。我们接下来将建立Slc26A4基因的纯合突变品系，在此基础上进一步研究该基因的功能。我们将利用膜片钳技术观察内耳毛细胞电流的变化；同时，我们将用转录组结合生物信息学分析的方法来研究内耳毛细胞的Cl-/HCO3-交换的分子机制。

图6 Slc26A4基因纯合突变胚胎整体发育正常(50×)。a对照组；bSlc26A4基因纯合突变体。结果显示Slc26A4基因纯合突变体与野生型相比，外表没有明显变化。Fig.6 Slc26A4 null mutant has no obvious defect(50×).a:control;b:Slc26A4 Homozygous mutant.The result showed that the Slc26A4 homozygous mutant had no obvious differ‐ence compared to the wild type.

本研究构建了Slc26A4基因敲除斑马鱼模型，为后续的Slc26A4基因功能研究提供了良好的基础。在接下来的研究中，我们将利用斑马鱼模型进行内耳结构和功能的深入研究，并进行相关基因的编辑和调控，对其上下游的因子进行调节，以进一步深入研究EVAS的病理机制和新的防治方案。