亳菊内生菌BN7的鉴定与生防促生功能研究

陆 娟，唐 娟，王贵生，余梅霞,2，唐 俊,2*

1阜阳师范大学生物与食品工程学院；2环境激素与生殖发育安徽省重点实验室，阜阳 236037

植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在健康的植物组织或细胞内并且没有引起宿主明显病害症状的一类微生物类群[1]。植物的整个生长过程就是宿主植物和内生菌共同体的生命过程[2]。内生菌与宿主植物及周围的生活环境形成了比较复杂的生态关系。内生菌可以产生与宿主相似的代谢产物，并赋予植物抵抗生物和非生物胁迫的能力[3]。在内生菌与植物长期互作过程中，内生菌表现出了增强宿主植物对磷、钾等矿质元素的分解和吸收的特性。筛选对植物病原菌具有拮抗作用又有解磷、解钾、产生长素等多功能菌株在农业中具有较大的应用潜力。

菊花具有清热消暑、抗氧化[4]的作用，同时还具有抑菌消炎[5,6]、减肥[7,8]和缓解高尿酸血相关的疾病[9]等功效。作为四大药用菊花之一的亳菊，本课题组已对它的内生真菌进行了初步研究。本试验对亳菊内生细菌BN7的抑菌、解磷、解钾、促生、纤维素降解和抗氧化等活性进行研究，并且对其进行初步鉴定，为丰富生物防治资源和生物菌肥的研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

亳菊内生菌BN7，由阜阳师范大学王贵生等从亳菊中分离筛选获得[10]，并保存于微生物实验室。

1.2 供试病原菌

玉米弯孢菌(Curvularialunata)CY1、黄瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)FH1、小麦赤霉菌(Fusariumgraminearum)FM1、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)F1、瓜炭疽菌(Colletotrichumlagenarium)CG1、茶叶轮斑菌(Pestalotiopsistheae)PC1，保存于阜阳师范大学微生物实验室。

1.3 培养基

所用培养基有PDA培养基、LB细菌纯化培养基，解有机磷培养基和无机磷细菌培养基，解钾菌分离培养基[11]、解钾液体培养基[12]、含有L-色氨酸的R2A培养基[13]、羧甲基纤维素钠培养基[14]、羧甲基纤维素酶活(CMCase)检测培养基[15]和滤纸酶活(FPase)检测培养基[14]。

1.4 主要仪器与试剂

仪器：T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，中国)；JS-680D全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司，中国)；T100 PCR仪(Bio-rad公司，美国)；ZWY-2112B恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司，中国)；Olympus-BX53正置荧光显微镜(奥林巴斯公司，日本)。

试剂：钼锑抗显色剂、四苯硼酸钠溶液、Salkowski比色液、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、PCR反应试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等均购于上海生工生物工程股份有限公司。

1.5 拮抗植物病原菌的测定

将亳菊内生菌BN7及6种植物病原菌分别接种LB和PDA平板进行活化培养。平板对峙培养法测定亳菊内生菌BN7对玉米弯孢菌CY1等6种植物病原菌的抑菌活性，以未进行对峙培养的植物病原菌为空白对照，按照下面公式计算抑菌率，具体方法参考Wang等[10]的研究，抑菌率=[菌落半径(CK)-菌落半径(处理)]/[菌落半径(CK)-2.5 mm]×100%。

1.6 解磷能力测定

将菌株BN7单菌落分别点种解有机磷、无机磷固体平板，37 ℃培养3天，观察并测量解磷透明圈直径。菌株BN7接种液体有机磷、无机磷培养基，150 rpm、28 ℃培养3天，钼锑抗比色法测定培养液中可溶性磷含量[16]，以不接菌培养基为空白对照，以y=2.144 3x+0.000 4(R2=0.998)为标准方程，式中x为720 nm处吸光值，y为磷浓度。

1.7 解钾能力测定

将菌株BN7在以钾长石为唯一钾源的解钾菌分离培养基上划线，37 ℃培养，若能生长，则该菌株有解钾活性，以E.coli作为阴性对照。将菌株BN7接种解钾液体培养基，28 ℃、160 rpm培养7天，以加等量灭活种子液为空白对照，测定菌浓度(OD600)，四苯硼钠法测定培养液中水溶性钾含量[17]，以y=118.68x(R2=0.991 9)为标准方程，式中x为420 nm处吸光值，y为钾浓度。

1.8 产IAA能力测定[13]

将BN7菌株接种含有L-色氨酸的R2A液体培养基，摇床培养4天，取1 mL菌悬液加入1 mL Salkowski比色液(50 mL 35% HClO4+ 1 mL 0.5 mol/L FeCl3)，以在比色液中加入1 mL 50 mg/L的植物生长激素(IAA)作为阳性对照，室温避光放置30 min，颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的IAA越多，不变色为阴性。Salkowski比色法测定BN7菌株发酵液中IAA含量，以y=0.018 8x+0.002 7(R2=0.995 2)为标准方程，式中x为IAA浓度，y为530 nm处吸光值。

1.9 纤维素降解能力测定

方法参考Wang等[10]的研究。将BN7菌株点种羧甲基纤维素钠培养基平板，37 ℃培养4天，刚果红染色，通过透明圈直径与菌落直径比值的大小定性测定BN7菌株纤维素降解能力的强弱。将BN7菌株接种CMCase检测培养基及FPase检测培养基，分别振荡培养7天，每隔24 h取样一次，DNS法测定上清液中的葡萄糖含量，以y=0.177 6x+0.005 6(R2=0.998 5)为标准方程，式中y为葡萄糖，x为530 nm处吸光值，定量检测CMC酶活及FPase酶活[14，15]。酶活力单位的定义：以每毫升发酵上清液酶促反应30 min释放1 μg葡萄糖的量为一个酶活单位(U)。

1.10 DPPH清除能力的测定

将BN7接种LB液体培养基，37 ℃、160 rpm培养7天，6 000 rpm离心10 min，取上清液，经0.22 μm无菌滤膜过滤得无菌发酵液，测定并计算发酵液清除DPPH的能力，具体方法同文献[10]，以y=9.295 6x+0.004 3(R2=0.999 6)为标准方程，式中y为517 nm处吸光值，x为DPPH浓度。

1.11 菌株鉴定

1.11.1 形态学观察

将菌株BN7在LB平板上划线培养24 h，观察菌落大小、颜色、形状等特征，并进行革兰氏染色、芽孢染色。

1.11.2 生理生化鉴定

参照《常用细菌系统鉴定手册》[18]和《伯杰细菌鉴定手册》[19]，对BN7进行生理生化鉴定，包括产酸产气试验、甲基红试验、VP试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原作用试验、精氨酸双水解酶和诱导产生青霉素酶试验等。

1.11.3 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取内生菌BN7总DNA，以总DNA作为模板，用细菌通用引物进行PCR扩增，引物序列及反应体系参考Lu等[20]的研究。PCR反应程序依次为94 ℃(30 s)、52 ℃(30 s)、72 ℃(1.5 min)、72 ℃(10 min)，30个循环。反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将纯化的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。根据测序结果，在GenBank数据库中进行BLAST比对，搜索同源序列，选取有代表性菌株序列利用MEGA7.0软件进行系统发育分析，NJ法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株BN7拮抗植物病原菌的作用

亳菊内生菌BN7具有广谱抗菌作用，对玉米弯孢菌CY1等6种植物病原菌均有抑制作用(见图1和图2)，抑制率在30%～68%之间，且对小麦赤霉菌FM1的抑制作用最强，抑制率为68.27%(见图3)。

图1 病原真菌在PDA平板上的培养特征Fig.1 Culture characteristics of pathogenic fungi on PDA plates注：A.玉米弯孢菌CY1；B.小麦赤霉菌FM1；C.串珠镰刀菌F1；D.黄瓜枯萎菌FH1；E.瓜炭疽菌CG1；F.茶叶轮斑菌PC1；图2、3同。Note:A.C.lunata CY1;B.F.graminearum FM1;C.F.moniliforme F1;D.F.oxysporum FH1;E.C.lagenarium CG1;F.P.theae PC1;Same forFig.2 and 3.

图2 菌株BN7对6种病原真菌的拮抗作用Fig.2 The antagonistic activity of strain BN7 on six pathogenic fungi

图3 菌株BN7对6种病原菌的抑制作用Fig.3 The inhibition effect of strain BN7 on six pathogenic fungi

2.2 菌株BN7解磷能力的测定

菌株BN7对无机磷和有机磷都有一定的溶解作用。有机磷的解磷圈(25.8 mm)比无机磷的解磷圈(17.3 mm)大，并且有机磷发酵液比无机磷发酵液中的可溶性磷含量高，分别为108.38 和68.71 mg/L，表明菌株BN7溶解有机磷效果较无机磷好。

2.3 菌株BN7解钾能力的测定

在以钾长石为钾源的分离平板上，菌株BN7可以正常生长(见图4)，但E.coli不能生长，表明菌株BN7具有解钾菌的特性；在解钾液体培养基中，菌株BN7比E.coli生长得好，并且菌株BN7发酵液的可溶性钾含量(32.03 mg/L)比E.coli发酵液高(见表1)。

表1 菌株BN7的解钾能力

图4 解钾平板上的菌株BN7Fig.4 Strain BN7 on potassium plate

2.4 菌株BN7产IAA能力的测定

在加入Salkowski比色液后，50 mg/L的IAA呈粉色，菌株BN7的R2A发酵液呈红色，表明该菌株具有分泌生长素IAA的能力，根据标准曲线计算得出菌株BN7分泌的IAA高达164.39 mg/L。

2.5 菌株BN7纤维素降解能力的测定

菌株BN7可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，经刚果红染色后产生明显的纤维素降解圈(见图5)，37 ℃培养4天后降解圈直径与菌落直径的比值较大(2.17 ±0.582)，初步说明内生菌BN7具有较强的纤维素降解能力。菌株BN7接种CMCase和FPase检测培养基后发酵培养1周，根据葡萄糖标准曲线计算发酵上清液的还原糖生成量并计算CMCase和FPase的活力。如图6所示，菌株BN7发酵液上清的CMCase和FPase酶活都在第3天最高，分别为168.78 和79.87 U/mL。

图5 菌株BN7的纤维素降解能力Fig.5 Cellulose degradation capability of strain BN7

图6 不同培养时间菌株BN7的CMCase和FPase活力Fig.6 CMCase and FPase activity of strain BN7 at different incubation time

2.6 菌株BN7清除DPPH能力的测定

培养7天的菌株BN7发酵上清液对DPPH 自由基的清除率为82.13%，对照组Vc对DPPH自由基的清除率为93.5%，表明菌株BN7具有较强的清除DPPH能力。

2.7 菌株BN7的鉴定

菌株BN7菌落光滑，圆形，表面湿润，易挑取，淡黄色，不透明，正反面颜色一致；细菌革兰氏染色阳性，杆状，链状排列，芽孢中生(见图7)。

图7 菌株BN7菌落形态及芽孢染色Fig.7 Colony morphology and spore staining of strain BN7注：A.LB平板上的BN7；B.芽孢染色。Note:A.Colony morphology of strain BN7 on LB plate;B.Spore staining of strain BN7.

菌株BN7产酸试验、淀粉水解试验呈阳性，产气试验、甲基红试验、VP试验、硝酸盐还原作用试验、精氨酸双水解酶和诱导产生青霉素酶试验等都呈阴性。

通过CTAB法提取获得亳菊内生菌BN7基因组DNA片段，利用通用引物对其进行特异性扩增，获得长约1 500 bp的条带，经测序，该扩增产物的长度为1 427 bp，根据GenBank数据库的基因序列构建生物进化树，菌株BN7与相似度为99%的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)NBRC 15308聚在一起，它们的亲缘关系最近(见图8)。

图8 基于NJ法构建的菌株BN7系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of strain BN7 based on NJ method

因此，结合形态学观察、生理生化试验和16S rDNA结果初步将菌株BN7鉴定为巨大芽孢杆菌，Genbank登录号为MW736394.1。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60467。

3 讨论

20世纪70年代末期，Dobereiner等[21]发现固氮螺菌可以促进非豆科植物的生长；80年代后期加拿大的Philom Bios公司开始生产、销售可以使小麦、油菜、豌豆等作物增产10%～15%的解磷菌剂、固氮菌剂和解磷固氮混合菌剂[22]。随后，植物内生菌逐渐成为国内外研究的热点。2009年，Cheng等[23]从华重楼中筛选得到一株内生菌PCE45，它产生的抗菌肽PCP-1对玉米弯孢菌Boed、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)Cav等多种病原菌均具有抑制作用。2010年，Bressan等[24]从玉米植物组织中分离到6株可以产生几丁质酶的内生芽孢杆菌，它们对串珠镰刀菌都有抑制作用。2015年，Zhao等[25]从大豆根瘤中筛选出36株溶磷内生菌，其中菌株DD291发酵液中可溶性磷含量高达452 mg/L，并且，部分溶磷菌株对大豆的生长具有促进作用。2015年，Kang等[26]研究发现苜蓿内生菌ASR16、ALR33均能产生植物生长激素、嗜铁素，具有溶解磷活性，对苜蓿的促生作用明显。2018年，Gao等[27]从尼瓦拉野生稻中分离到57株内生细菌，其中44株内生固氮菌均有产生长素的能力，25株菌株具有不同程度的解钾能力。2018年，Bai等[28]从野生黄精根茎中分离得到一株内生芽孢杆菌HJ-1，该菌对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)均具有显著抑菌作用。

目前，人们对亳菊内生菌的研究较少，对亳菊内生菌促生作用的研究也鲜为报道。本研究中的亳菊内生菌BN7对玉米弯孢菌CY1等6种植物病原菌均具有拮抗作用，对小麦赤霉菌FM1抑菌率最高，为68%。该菌株还具有一定的解磷、解钾和产IAA的能力，分别为108.38、32.03和164.39 mg/L。菌株BN7解无机磷的能力(68.71 mg/L)约是樟树内生巨大芽孢杆菌ZS-3(20.16 mg/L)[29]的3倍，可能与后者培养时间较短(24 h)有一定的关系；另外，菌株BN7产生长素的能力是郜晨等筛选的产生长素能力最强菌株N8(41.66 mg/L)[27]的4倍。菌株BN7还具有降解纤维素的能力，它的CMCase和FPase酶活在第3天分别为168.78 U/mL和79.87 U/mL。除此以外它清除DPPH自由基活性高达82.13%，远高于先前筛选的亳菊内生真菌BJF10对DPPH的清除率(67.7%)[10]。根据形态学特征、生理生化试验及对16S rDNA序列的分析，菌株BN7被鉴定为巨大芽孢杆菌。因此，巨大芽孢杆菌BN7是一株具有拮抗植物病原菌、解磷、解钾和产生IAA能力的亳菊内生细菌，具有开发为生防促生菌剂的潜能。