雄性APP/PS1/Tau 三转基因小鼠阿尔茨海默病样病理的年龄相关性变化

刘 硕， 朱 昆， 王国庆， 张潇怡， 杜 娟， 曹云鹏

阿尔茨海默病(AD)是痴呆中最典型的疾病，占所有痴呆病例的50%至60%[1]。AD的典型病理标志是神经元内的神经原纤维缠结(NFT)和细胞外的淀粉样斑块(SP)沉积[2]，此外还包括神经突触营养不良、星形胶质细胞增生、小胶质细胞活化以成熟神经元标记物改变等[3]。目前，越来越多种类的转基因鼠模型在AD的研究中做出贡献[4，5]，其中APP/PS1/Tau三转基因小鼠(3xTg-AD)是最常用的AD转基因模型之一。3xTg-AD小鼠同时表达3种罕见的家族突变基因：人PS1M146V、人APPswe和人tauP301L，在评估共同进化的淀粉样蛋白和tau病理学方面具有重要参考价值[6]。本实验主要探究2～15月龄雄性3xTg-AD小鼠每两个月脑组织AD相关性病理形态学变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 我们采用3xTg-AD小鼠共21只，C5B7L/6J(野生型，WT) 共 21只，均为雄性，体重25～30 g，SPF级；3xTg-AD小鼠及C57BL/6J小鼠均由美国Jackson Laboratory公司提供。该实验经中国医科大学伦理委员会批准同意。

1.2 药物与主要试剂 封闭用山羊血清(Solarbio，SL038)、鼠SP法染色试剂盒(中杉金桥)、兔SP法染色试剂盒(中杉金桥)、DAB浓缩型试剂盒20X(Solarbio，DA1010)、Quick Block组化一抗稀释液(Beyotime，P0262)、一抗：6E10(BioLegend)、Tau Monoclonal Antibody(HT7，Invitrogen)、Phospho-Tau Monoclonal Antibody(AT8，Invitrogen)、GFAP(Abcam)、NEUN(Abcam)，蔗糖(沪试)、乙二醇(恒兴试剂)二水合磷酸二氢钠(沪试)、十二水合磷酸氢二钠(沪试)、柠檬酸钠(Solarbio)、苏木素(Solarbio)、酸性乙醇分化液(Solarbio)、免疫组化笔(迈新试剂)。

1.3 仪器 平推切片机(Leica)；正置倒置一体荧光显微镜(Echo Revolve)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 雄性3xTg-AD三转基因小鼠按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组，每组各3只，作为实验组；雄性C5B7L/6J小鼠(Wild Type，WT)按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组，每组各3只，作为对照组。

1.4.2 心脏灌流法获取脑组织 按体重计算小鼠所需麻醉剂量；将小鼠固定于手术台，用镊子提起剑突处的皮肤，外科手术剪剪开皮肤及肋骨，暴露心脏及肝脏，分离小鼠心脏周围系膜，剪开鼠右心耳，使血液流出，同时将抽取10 ml生理盐水的注射器插入小鼠左心室，灌注生理盐水，待肝脏显白色后停止灌注；剪断小鼠颈部，从颈部向前沿中线剪开小鼠头部皮肤，于小鼠嗅球处剪断颅骨，暴露大脑完整形态，沿大脑正中裂剪开颅骨，用镊子将双侧颅骨分离，暴露大脑及小脑，从小脑底部向前分离脑组织，将大脑及小脑至于含有生理盐水的表面皿中，用刀片切割小脑及左右大脑半球，分装于2 ml离心管中备用。

1.4.3 沉糖 自来水冲洗4%多聚甲醛固定的脑组织 24～72 h；冲洗后脑组织放入30%蔗糖溶液中，待其沉入管底。

1.4.4 切片 使用Leica平推切片机，切片厚度为20 μm，到达海马后每1 mm装入同一冻存管，4 ℃保存。

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1.4.5 捞片 取出冻存管中的组织切片，磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min；取出组织切片完整且不重叠地吸附在载玻片上，室温风干3 h以上。

1.4.6 抗原修复 将吸附有组织切片的载玻片放入大约60 ℃的柠檬酸钠(pH=6.0)抗原修复液中，微波炉加热修复，自然冷却至室温，吸水纸正反面擦干玻片，免疫组化笔沿切片边缘画圈。

1.4.7 免疫反应 磷酸缓冲液(0.01 mol/L) 冲洗3次，每次1 min；灭活内源性过氧化酶(3%过氧化氢)孵育15 min；磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min；10%山羊血清封闭30 min；加入6E10、HT7、AT8、GFAP、NEUN一抗(稀释比例按说明书)，4 ℃过夜；磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min；加入二抗，室温反应2 h；磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min；加入生物素-链霉卵白素试剂，室温反应30 min；磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min。

1.4.8 染色 滴加DAB显色液室温避光反应15 min；磷酸缓冲液(0.01 mol/L)冲洗3次，每次1 min；滴加苏木素染液，室温反应1 min，放入自来水中中止反应；酸性乙醇分化液分化2～5 s，水洗；返蓝1～2 s，水洗。

1.4.9 脱水 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分别脱水2、2、4、4、4、4 min。

1.4.10 封片 将中性树胶滴于组织上，盖玻片盖于封片剂顶端，通风橱内持续通风24～48 h。

1.4.11 观察拍照。

1.5 统计学方法

2 结 果

A：3xTg-AD小鼠与WT小鼠海马2～15 m龄(m)CA1区Aβ(6E10)免疫染色。B：3xTg-AD小鼠与WT小鼠2～15 m龄(m)感觉皮质区Aβ(6E10)免疫染色。比例尺=120 μm

A：3xTg-AD小鼠与WT小鼠海马CA1区2～15 m龄(m)tau 蛋白 AT8(Ser202/Thr205)免疫染色。B：3xTg-AD小鼠与WT小鼠感觉皮质区2～15 m龄(m)tau 蛋白 AT8(Ser202/Thr205)免疫染色。比例尺=120 μm

A：3xTg-AD小鼠与WT小鼠海马CA1区2～15 m龄(m)GFAP免疫染色，B：3xTg-AD小鼠与WT小鼠感觉皮质2～15 m龄(m)GFAP免疫染色。比例尺=150 μm

A：3xTg小鼠与WT小鼠海马CA1区2～15月龄(m)Neun免疫染色，B：3xTg小鼠与WT小鼠海马CA3区2～15月龄(m)Neun免疫染色。比例尺=100 μm

3 讨 论

3xTg-AD小鼠是一种信息丰富的临床前模型，越来越多地用于检查AD潜在的机制。本研究目的在于用免疫组化方法检测2～15月龄雄性3xTg-AD小鼠海马和感觉皮质中，淀粉样蛋白沉积，致病性Tau磷酸化、星形胶质增生以及成熟神经元标记物的演变。

抗淀粉样蛋白抗体一直是AD等神经退行性疾病研究的重点，它们是重要的研究工具和潜在的治疗剂。尽管已经开发了针对淀粉样蛋白Aβ的100多种不同的单克隆抗体，但两种最常用的单克隆抗体是6E10和4G8，其中6E10对人Aβ具有特异性[7]。本研究发现，2～15月龄雄性3xTg-AD小鼠，没有明显的淀粉样斑块沉积，可能主要是由于性别因素的影响。CA1区6E10阳性神经元染色强度2～8月龄稳定，8月龄后开始逐渐增强；但在感觉皮质区染色强度没有显著差异。

Tau是一种磷蛋白，正常低水平的磷酸化才能使Tau发挥最佳功能，而高水平异常磷酸化的Tau则失去其生物学活性[8]。异常磷酸化的Tau逐渐导致轴突运输功能丧失而直接或间接地在AD的发病机制中起着中心作用。影响AD最主要的十个超磷酸化位点是Ser198，Ser199，Ser202，Thr231，Ser235，Ser396，Ser404，Ser409，Ser413和Ser422[9]。本研究发现，雄性3xTg-AD小鼠海马CA1区2、4、6月龄之间AT8 磷酸化程度没有显著差异，6月龄后AT8磷酸化程度开始升高；感觉皮质区2、4、6、8、10月龄之间磷酸化程度没有显著差异，12月龄后磷酸化程度开始升高。

人类tau P301L突变是3xTg-AD小鼠中携带的转基因之一，常用于研究人类Tau蛋白病(如进行性核上性麻痹，皮质基底变性，额颞痴呆等)的小鼠模型中[10]。使用单克隆抗体HT7可以检测到人tau P301L突变体的转基因产物。本研究发现，雄性3xTg-AD小鼠从2个月龄开始，就可以在海马CA1中检测到人tau P301L转基因产物，但在感觉皮质中数量非常有限。海马CA1区2～6月龄HT7染色程度降低，6～15月龄染色程度保持稳定；感觉皮质区2～4月龄HT7染色程度增加，4～15月龄染色程度保持稳定。人Tau蛋白表观水平的此类变化可能是由于Tau磷酸化状态的年龄相关性，从而导致HT7表位的位阻和/或结构改变。

近十几年，神经炎症的作用逐渐成为学术界的热点[11]。星形胶质细胞是神经系统中最丰富的神经胶质细胞类型，通过增生对神经退行性疾病做出反应，即转化为反应性炎症状态[12，13]。胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)通常用作星形细胞活化的标志物[13]，GFAP免疫染色被认为是鉴定星形胶质细胞最常规的技术。本研究发现，2～15月龄雄性3xTg-AD小鼠显示出明显的与年龄相关的GFAP阳性星形胶质细胞染色强度，海马CA1区及感觉皮质GFAP反应性从2月龄就开始逐月龄升高。

神经元核(NEUN)是公认的“标记物”，仅在有丝分裂后的神经元中被检测到。在过去的20年中，NEUN被认为是成熟神经元的可靠标记[14]。NEUN的表达水平已直接用于评估神经元的死亡或丧失，NEUN阳性细胞已成为量化治疗研究实验中治疗效果的可靠指标[15]。本研究发现，2～15月龄雄性3xTg-AD小鼠与WT小鼠NEUN染色强度均逐渐下降，3xTg-AD小鼠染色强度显著低于年龄匹配的WT小鼠；NEUN阳性细胞的定量显示，与年龄匹配的WT组相比，3xTg-AD小鼠6月龄时海马CA1和CA3区NEUN阳性细胞数量显着减少，CA1区6～15月龄数量逐渐稳定，CA3区6～15月龄数量逐渐降低。

先前研究表明雌性3xTg-AD小鼠表现出较雄性更早的AD病理发作[16]，这可能是孕酮和雌激素介导的信号传导机制造成的。雄性和雌性3xTg-AD小鼠在特定的发作时间和行为表型存在严重性差异，同时，每个性别潜在的神经炎性状态是完全不同的，可能显着影响基于免疫特定治疗剂的功效、安全性，因此必须充分认识到该模型的区域、时间及性别特定的细微差别和局限性。总的来说，3xTg-AD小鼠在年龄和表型的发展之间显示出明显的相互作用，这使其成为研究衰老在疾病发病机制中作用的重要工具。