染料木黄酮增强阿比特龙抑制去势抵抗前列腺癌细胞22RV1效应研究

伏天雨，周圆媛，陈 恬，冯海娇，彭 湃，朱彦锋

前列腺癌是全球男性人群最常见的泌尿生殖系统的恶性肿瘤。2018年全球癌症统计报告显示全球新发病例排名第4位的是前列腺癌，男性病例中前列腺癌排名第2位。我国男性前列腺癌发病率居第6位，病死率居第7位。2018年全球新增前列腺癌患者127.6万例，死亡35.9万例。前列腺癌的生长与雄激素睾酮升高有关，去除睾酮是针对晚期前列腺癌的治疗方法。但经过2～3年后，肿瘤不再受雄激素的控制，会继续增长。经过初次持续雄激素剥夺治疗后疾病依然进展的前列腺癌，把这个阶段称之为去势抵抗前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。染料木黄酮(genistein，GEN)是大豆异黄酮中的一种生物学功能成分。研究证明大豆异黄酮可防治与激素有关的癌症，其具有抗前列腺癌的活性，主要表现在抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和侵袭以及与抗癌药物的协同，对前列腺癌细胞产生拮抗作用。阿比特龙(abiraterone,ABT)可抑制细胞色素P450c17(CYP17A1)，从而降低CRPC患者的雄激素水平、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)水平，发挥抗肿瘤作用。目前通过体外实验利用GEN增强ABT抗CRPC作用效果的相关研究甚少。该研究旨在探讨GEN可在体外增强ABT对CRPC细胞的抑制作用，并初步探讨其作用机制。该研究探索了植物化学物质辅助治疗CRPC的新方法，从膳食联合用药的角度为防治肿瘤提供了新思路，具有较大的生物医学意义。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

CRPC细胞株22RV1(中国科学院上海细胞库)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天)，ELISA试剂盒(中国Elabscience)，GEN和DMSO(美国Sigma)，ABT(中国MCE)，无酚红RPMI-1640 培养液和无酚红DMEM高糖培养液(以色列Biological Industries)，胎牛血清(美国Gibco)，蛋白酶抑制剂混合物(中国凯基)，Western blot及IP细胞裂解液(中国碧云天)，Western blot化学发光HRP底物(美国Millipore)，Anti-PSA(美国Santa Cruz)，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，AKR1C3单抗，Anti-CYP17A1及Anti-Ki67(美国Abcam)，Anti-β-actin和Anti-GAPDH(中国中杉金桥)。

1.2 细胞培养

将22RV1用含10%胎牛血清的培养基，置细胞培养箱培养，培养环境为37 ℃、5% CO，传代至所需细胞量备用，选对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞增殖实验

将对数期细胞用胰酶消化，制成细胞悬液。稀释至5×10个/ml细胞，细胞按5 000个/孔的密度接种于96孔板。37 ℃、5% CO及饱和湿度条件下种板24 h。加入终浓度为0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的ABT在对应孔，设5个复孔，培养24、48、72 h。配置终浓度为0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L的GEN，加入对应孔，培养48 h。用40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN混合，同样配制培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，加入对应孔，培育24 h。最终每孔加入100 μl MTT孵育4 h，再加入150 μl DMSO，用酶标仪检测490 nm处的吸光度。细胞活力=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.4 免疫细胞化学实验

将22RV1细胞接种于6孔板，每孔20 000个。在37 ℃、5% CO及饱和湿度条件下培养24 h。加入100 μl GEN与ABT的混合培养液，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，并于37 ℃、5% CO培养箱培养48 h，体积分数4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-100 通透，5% BSA 常温下封闭1 h。孵育抗体兔抗人Ki-67单克隆抗体，并于4 ℃孵箱过夜。在常温下避光孵育1 h二抗山羊抗兔 IgG，用 DAPI 复染，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 Western blot检测蛋白的表达

配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在37 ℃培养箱中培养22RV1细胞48 h，加入预冷的PBS将处理液冲洗3次直至干净。在冰上用裂解液裂解20 min，收集细胞裂解液，7 200 r/min 离心15 min，用BCA法对上清液进行蛋白定量并分装保存于-70 ℃待用。制备 SDS-PAGE凝胶，利用80 V(浓缩胶)/120 V(分离胶)电压对蛋白质进行分离，100 V电压转膜90 min。PVDF膜用TBST冲洗，用5%脱脂牛奶封闭，室温震摇1～2 h。TBST洗膜3次，每次5 min，加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1 ∶4 000)室温孵育1.5 h。TBST洗膜3次，每次10 min。凝胶成像系统成像。

1.6 酶联免疫吸附试验

配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在37 ℃培养箱中培养22RV1细胞48 h。加入预冷的PBS，处理液冲洗3次至干净。用适量胰酶消化细胞，离心5 min，PBS冲洗3次后重悬。经过反复冻融，提取液再离心5 min，取上清液待用。最终按照试剂盒的具体操作步骤操作，测出标准品和待测样品的吸光度值，并绘制标准曲线图，并计算出样品的浓度。

2 结果

2.1 ABT对22RV1细胞活力有抑制作用

使用MTT比色法检测不同浓度的0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L ABT处理22RV1细胞24、48、72 h的细胞活性。结果显示ABT对22RV1细胞增殖具有抑制作用，且剂量越高，抑制作用越强、作用时间越长，抑制作用越强，呈明显的剂量、时间依赖关系(图1)。

图1 ABT对22RV1细胞增殖能力的影响A：ABT对22RV1处理24 h后增殖能力的影响；B：ABT对22RV1细胞处理48 h增殖能力的影响；C：ABT对22RV1细胞处理72 h增殖能力的影响；与Con组比较： *P<0.05

2.2 GEN可增强ABT对22RV1细胞的抑制作用

配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在体外对22RV1细胞处理48 h。MTT结果显示，GEN可在体外抑制CRPC细胞的活力，并可增强ABT对22RV1细胞的抑制作用(图2)。

图2 GEN联合ABT对CRPC细胞活力的影响A：GEN对22RV1细胞活力的影响；B：GEN联合ABT对22RV1细胞增殖能力的影响；1：control组；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L；与control组比较：*P<0.05；与ABT组比较：#P<0.05

2.3 GEN可增强ABT对Ki-67的抑制作用

配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，处理22RV1细胞48 h。免疫细胞化学法结果显示，GEN可增强ABT对Ki-67的抑制作用(图3)。

图3 GEN和ABT联合作用对22RV1细胞Ki-67表达的影响 ×2001：control组；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

2.4 GEN和ABT未能在体外显著降低22RV1细胞中的睾酮水平

配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度分别为0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，处理22RV1细胞24 h，ELISA法检测22RV1细胞裂解液中的睾酮水平，发现睾酮水平未显著下降，差异无统计学意义(图4)。

图4 GEN和ABT联合作用对22RV1细胞睾酮合成的影响1：control组；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

2.5 GEN和ABT未能显著降低CRPC细胞中CYP17A1的表达

研究中配制40 μmol/L ABT与不同剂量的GEN的混合培养基，终浓度为 0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，培养22RV1细胞 48 h。用Western blot法检测细胞中PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3的表达。实验结果显示，GEN和ABT联合时未能降低细胞中CYP17A1的表达，但对PCNA、PSA和AKR1C3有抑制作用(图5)。

图5 GEN和ABT联合或单独处理对22RV1细胞PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3表达的影响1：control组；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

3 讨论

临床研究证明GEN被认为是具有抗癌活性的天然药物，是抗肿瘤药物的先导植物型化合物之一。研究表明使用GEN可使22RV1细胞阻滞在G/M期，抑制Ki-67的表达，抑制CRPC细胞的增殖，最终达到抗前列腺癌的效果。GEN可能通过调控ER-akt、PSA、p21、Cyclin D1和CDK4的表达来抑制前列腺癌细胞的增殖，显示抗前列腺癌效果。此外临床上已有研究针对二期双盲临床试验，证实了GEN对前列腺癌患者的安全性和有效性。临床研究的初步结果肯定了GEN作为化学预防药物的潜力，并鼓励进一步的研究。

GEN和ABT都能通过抑制前列腺癌细胞的增殖，发挥抗肿瘤效应。有研究显示，GEN可以在体外抑制雄激素细胞的增殖。Ki-67是一种反映肿瘤细胞增殖情况的核抗原。本研究采用免疫组化法检测时，发现联合用药时，ABT的浓度一定时，随着GEN的浓度增加，抗原Ki-67的表达减少，表明GEN可增强ABT的抗CRPC能力。PCNA是增殖细胞核抗原，在肿瘤细胞增殖上起关键作用，是反映肿瘤细胞增殖的良好指标。本研究中GEN可增强ABT降低PCNA的能力，说明GEN能够增强ABT抗CRPC细胞增殖。血清PSA是前列腺癌的特异性标志物，是检测和早期发现前列腺癌最重要的指标之一。与正常人比较，前列腺癌患者的PSA水平较高，测量PSA的水平有助于前列腺癌的筛选。本研究中免疫印迹实验法检测前列腺癌特异性抗原PSA的表达，发现联合用药时随GEN剂量的增加，PSA的表达逐渐减弱，GEN可增强ABT的能力。ABT是CPY17酶抑制剂，与雄激素合成限速酶CYP17不可逆结合，抑制相关酶活性，进而阻断雄激素的合成，抑制前列腺癌细胞的增殖。 CYP17A1是治疗前列腺癌的重要靶点，可产生癌细胞生长所需的雄激素。ABT是CYP17A1抑制剂，它含有一种类似于内源性CYP17A1底物的甾体支架。在本研究中通过免疫印迹实验法检测CYP17A1的表达，未发现CYP17A1的表达减弱。原因可能是ABT是CYP17A1抑制剂，仅抑制CYP17A1的酶活性，使其失活导致不能进行后续反应，因而对CYP17A1的表达不会产生直接影响。AKR1C3是雄激素合成最后两步的关键酶，在CRPC中高表达。本研究发现GEN和ABT作用于22RV1细胞后，抑制AKR1C3的表达。类似有研究证明异黄酮类化合物对去势抵抗性前列腺癌靶标AKR1C3 具有较强的体外抑制活性作用。另有研究发现AKR1C3可以克服ABT耐药性并提高晚期前列腺癌患者的生存率。

本研究发现，与单独使用ABT比较，GEN和ABT联合作用时更能降低PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3及抗原Ki-67的表达，发挥更强的抑制作用，说明GEN能够增强ABT对CRPC细胞的抑制作用。CRPC是前列腺癌发展的后期阶段，使用内分泌治疗是现有的主要治疗方法，如采用GEN联合相应药物提升治疗效果，则可为CRPC的临床治疗提供新的思路。